SYBR Green I荧光定量PCRPPT.ppt

理论扩增曲线 实际扩增曲线 PCR扩增曲线 Rn（Normalized reporter）：是荧光报告基团的荧光发射强度与参比染料的荧光发射强度的比值。 △Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果（△Rn=Rn-基线）。 Tm值：双链DNA解链50%的温度。 数据分析： 相对定量：不用得到绝对的拷贝数，只需计算表达差异即可，得到的结果是某基因表达水平升高了或降低了多少倍。 2 -△△CT 表示实验组目的基因表达相对于对照组变化的倍数。 ΔCt =Ct 目的- Ct 内参 ΔΔCt = ΔCt实验组- ΔCt 对照组 第六部分：误差校正 模板方面的误差：IPC校正 取样量即细胞数量、抽提效率、纯化损失、反转录效率等 操作误差：ROX校正 试剂取用误差的主要部分、受耗材质量及仪器等影响而产生的荧光激发波动 其余误差：统计校正 重复实验，取平均值 总结 设计合格的引物。 适当浓度的模板。 设定内参和阴性对照。 使用合适的ROX。 实验时做复孔。 冰上操作。 第七部分：常见问题分析 问题1：无 Ct 值出现 检测荧光信号的步骤有误: 一般 SG 法采用 72℃延伸时采集。 引物或探针降解: 可通过 PAGE电泳检测其完整性。 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。 实时荧光定量PCR的应用 杨阳 2.11-08-31 主要内容 第一部分：PCR简介 第二部分：RNA的提取 第三部分：RT 第四部分：实时荧光定量PCR 第五部分：数据分析 第六部分：误差校正 第七部分：常见问题分析 第一部分：PCR简介 PCR技术的发明 v 1985年Kary.B.Mullis教 授发明了具有划时代意义的 PCR技术。 PCR Polymerase Chain Reaction vPCR (聚合酶链式反应)技术是一种体外快速扩增特定DNA片段的方法。 v 是一个在引物介导下反复进行热变性、退火、引物延伸三个步骤而扩增DNA的循环过程。 v运用PCR技术能快速特异地扩增所希望的目的DNA片段，使皮克(Pg，10－12）起始物达到微克（μg，10－6）水平。 PCR类型 RT-PCR 兼并引物PCR 巢式PCR 反向PCR 不对称PCR 原位PCR 重组PCR 荧光定量PCR 锚定PCR 多重PCR 定量PCR …… 实时荧光定量PCR技术real-time fluorescent quantitativePCRFQ-PCR 是一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过特定数学原理对未知模板进行定量分析的方法，实现了PCR从定性到定量的飞跃。 实时荧光定量PCR技术分类 荧光探针 Beacon法：以美国人Tagyi为代表 TaqMan探针:以美国ABI公司为代表 FRET技术:以罗氏公司为代表 荧光染料 饱和荧光染料: EvaGreen、LC Green 非饱和荧光染料:SYBR GreenⅠ 第二部分：RNA的提取 提RNA基本步骤 标本 Trizol 异丙醇 75%乙醇 DEPC水溶解 氯仿 RNA的抽提注意事项 所有用具去RNase处理 戴口罩、帽子，勤换手套，防外源RNase污染 尽量快速 4 ℃离心：室温会导致不适当分层，从而导 致变异RNA产物。 一、标本的处理 新鲜、低温保存、避免反复冻融。易至RNA降解，提取量下降。 二、匀浆：Trizol 裂解细胞，使核蛋白体解离，释放RNA；抑制RNase活性；酸性酚使RNA进入水相。 过多：上清液变为红色，浪费。 过少：未加氯仿前即分层。 裂解不充分， RNase抑制不充分，得率低，RNA完整性、纯度受损。 三、抽提、分层：氯仿 变性蛋白，抽提去除过多的酚，加速有机相与水相的分层。 过少：上述作用减弱，影响RNA质量。 过多：使DNA和蛋白进入水相，影响RNA质量。 四、沉淀：异丙醇 过多：会沉淀盐和其他污染物，使用乙醇不能洗脱。 五、洗涤： 75%乙醇 去盐作用，根据情况可重复几次。 六、溶解： DEPC水 掌握溶解时间。 太早：沉淀物太湿，含有乙醇会影响后续反应。 太迟：沉淀物太干，不易溶解。 RNA的抽提注意事