Cell文章中使用的一种新的高效蛋白纯化方法说明.pdf

Beijing Cellgen Biolabs Co.,Ltd. SSB 亲和层析使用说明书 一、 简介 噬菌体T7 单链DNA 结合蛋白（SSB, single‐stranded DNA binding protein ）由 696bp 核苷酸编码，计算分子量为 25.6kDa （SDS‐PAGE 凝胶电泳，该蛋白条带约 在27 kDa 位置）。它与单链DNA 有很强的亲和性，且无序列特异性。利用这一 特性，将SSB 构建到不同宿主的表达载体中，可以实现在不同宿主中表达带有 SSB 标签的融合蛋白，从而与偶联在介质中的单链DNA 高效、特异性结合，这种 结合是可逆的，能够在温和、非变性的条件下通过改变洗脱液的pH 值或盐浓度 对融合蛋白进行洗脱，达到纯化某一目标蛋白的目的。 pSSB 系列载体用于构建可诱导、高水平表达的基因或基因片段，表达的融 合蛋白的N 端或C 端带有SSB 标签。SSB 标签可根据需要由位点特异的蛋白酶切 除，pSSB 系列质粒上多克隆位点上游包含有肠激酶（enterokinase ）、凝血酶、TEV 等识别序列。带有标签的蛋白可以通过免疫学方法进行检测，同时根据实验需要 决定是否切除标签。 SSB 亲和层析介质（经过特殊处理的ssDNA‐cellulose ）是专门设计用于纯化 SSB 融合蛋白及与目的蛋白有亲和作用的蛋白复合体的分离介质，通过盐离子梯 度洗脱可得到高纯度的SSB 融合蛋白。纯化条件温和，不引入其他物质，能够保 证蛋白的活性。 二、 pSSB 载体 现有的pSSB 载体系列按宿主不同可以分为以下四类：1）大肠杆菌类; 2 ）酵 母类; 3 ）人细胞类；4 ）昆虫细胞类。每一个类别中均含有带有N 端和C 端的SSB 标签质粒，每个质粒都含有相应的蛋白酶切位点，可以根据实验需要，将SSB 标 签从融合蛋白中切去。在不同的宿主载体中，它们的启动子也各不相同，通过各 自的启动子实现严格调控插入片段的表达。相关参数如下页表一所示： Beijing Cellgen Biolabs Co.,Ltd. 表一：pSSB 系列载体 SSB 位于 目的蛋白 蛋白酶切 是否带His 宿主 载体 抗性 启动子 的N 端或C 位点 标签 端 pSSB‐E1 N 端 卡纳抗性 T7 肠激酶 否 pSSB‐E2 N 端 卡纳抗性 T7 肠激酶 是 N 端 pSSB‐E3 （ △ 卡纳抗性 T7 肠激酶 是 大肠杆菌 SSB( E.coli 26C)标签） pSSB‐E4 N 端 卡纳抗性 T7 凝血酶 是 pSSB‐E5 N 端 卡纳抗性 T7 凝血酶 否 pSSB‐E6 C 端 卡纳抗性 T7 肠激酶 是 pSSB‐Y1 N 端 卡纳抗性 nmt1 肠激酶 是 酵母Yeast pSSB‐Y2 N 端 氨苄抗性 nmt1 肠激酶 是 pSSB‐Y3 C 端 氨苄抗性 nmt1 肠激酶