小鼠脾脏细胞原代培养及死、活细胞计数.pdf

细胞生物学实验报告 题目：小鼠脾脏细胞原代培养及死、活细胞计数 姓名：余振洋 学号：200900140156 系年级：09 级生科三班 时间：2011/5/26 一、【实验目的】 1、了解原代细胞培养的基本方法及操作过程，初步掌握无菌操作的方法。 2、学习细胞计数的方法。 3、学习并掌握死活细胞鉴别的原理及方法。 二、【实验材料】 1．实验仪器：解剖刀、解剖镊、解剖盘、无菌培养皿、滴管、“L”形针头、Eppendorf 管、塑料培养皿、移液枪、离心机、试管及试管架、血球计数板、显微镜、标记 笔、超净工作台、CO2 培养箱等 2 ．实验试剂：PBS 液、台盼蓝染液，75%酒精、生理盐水 3 ．材料：小白鼠 三、【实验原理】 1．细胞原代培养 原代细胞培养是指直接从动物体内获首取的细胞、组织或器官，经体外培养 后，直到第一次传代为止。这种培养，首先用无菌操作的方法，从动物体内取出 所需的组织（或器官），经消化，分散成为单个游离的细胞，在人工培养下，使 其不断的生长和繁殖。 细胞能在体外长期生长，必须满足两个基本要求：一是供给细胞存活所必须 的条件，如适量的水、无机盐、氨基酸、维生素、葡萄糖及其有关的生长因子、 氧气、适宜的温度，注意外环境酸碱度与渗透压的调节。二是严格控制无菌条件。 细胞培养技术目前已经被广泛地应用于生物学各个领域。如分子生物学、细 胞生物学、遗传学、免疫学、肿瘤学以及病毒学等。 2 ．细胞死活鉴定。 常用细胞死活鉴定方法有台盼蓝法：细胞损伤或死亡时，台盼蓝可穿透变性 的细胞膜，与解体的DNA 结合，使其着色呈蓝色。而活细胞能阻止染料进入细 胞内，呈无色。故可以鉴别死细胞与活细胞。本次实验即采用此方法。伊红 Y 法： 细胞悬液与3 倍量的0.15%伊红染液混合，2min 后制片镜检，死细胞被染成红色 而活细胞呈无色。 3 ．细胞计数： 血球计数板（如图1 所示）是一块特制的厚载玻片，载玻片上由4 条槽而构 成3 个平台。中间的平台较宽，其中间又被一短横槽分隔成两半，每个半边上面 各有一个方格网，每个方格网共分9 大格，其中的一大格即为计数室。计数室的 刻度有两种：一种是大方格分为16 个中方格，而每个中方格又分成25 个小方格； 另一种是一个大方格分成25 个中方格，而每个中方格又分成16 个小方格。但是 不管计数室是哪一种构造，每个大方格都由400 个小方格组成。每个大方格边长 为1mm，则每一大方格的面积为1mm2，盖上盖玻片后，盖玻片与计数室底部 之间的高度为0.1mm ，所以每个大方格的体积为0.1mm3 。 原细胞悬液细胞数/ml= n ×10000 ×稀释倍数；n=四大格内的细胞总数。 4 图1 血细胞计数板计数区示意 四、【操作步骤】 1、小鼠脾细胞原代培养 （1）取材： 取小白鼠一只，采用断头法处死。浸入75%酒精中消毒3 分钟，取出转入超 净工作台内的解剖盘内，无菌操作打开腹腔，取出脾脏，去除周围的脂肪组织， 用镊子夹起脾脏用PBS 液自上而下冲洗1-2 次，转入无菌培养皿中待用。 （2 ）分离脾细胞： 用滴管先向上述无菌培养皿中滴入PBS 液30 滴，再用“L”形针头注射器在 皿中吸取PBS 液0.2mL.沿脾长轴方向注射入脾内（使脾脏膨胀以利于细胞散开）。 然后用针尖在脾脏上扎眼，并用“L”形针头轻轻刮挤出脾细胞于脾脏，用滴管 吹散刮出的细胞，稍倾斜培养皿并静置1~2 分钟。 吸取上述分离出的单个脾细胞悬液，放入Eppendorf 管中，使量至1mL，以 3000r/min 离心1~2 分钟。 （3 ）脾细胞培养 取塑料培养皿一个，用移液枪（1mL）加入细胞培养液2mL，在盖上加标记 后待用。 用移液枪（200 μL）吸取塑料皿中的培养液400 μL，加入上述离心后并弃 去上清液的Eppendorf 管中，用枪头吹散并混匀细胞，然后吸取200 μL 接种于 上述塑料培养皿中，混匀，放入37℃，5%CO2 培养箱中培养。