光散射法对蛋白质溶液的检测.pptxVIP

光散射检测技术在蛋白质大分子溶液中的应用;蛋白质是最基本的生命物质基础，是生物细胞的基本构成物质，在生物的生命活动中起着重要的作用，几乎所有的酶都是由蛋白质组成的。它可调节生理功能、作为药物分子、矿物质、维生素和微量元素载体并可为给体提供所需能量。此外，酶可以直接表达生物性状，动植物及微生物细胞内特定酶含量的变化也是诊断疾病的重要依据，其含量能够反映机体的健康状况。;三聚氰胺含氮量为66.6%，是牛奶的151倍，是奶粉的23倍。凯氏定氮法实际上测的不是蛋白质含量，是通过测定氮含量来推算蛋白质含量，因此测定的是粗蛋白，不能够区别蛋白氮和非蛋白氮.牛奶和奶粉添加三聚氰胺，主要是因为它能冒充蛋白质。;在研究污染物中，我们要想了解植物的耐抗性，怎么定量的描述呢？通过准确的检测特定蛋白酶的数量，了解植物对污染物的耐抗性。;;蛋白质是高分子化合物，在水中呈胶体。蛋白质是大分子，外带大部分是极性基团，有水化膜，具有同种电性，因而在水中能形成稳定的胶体。维持蛋白质溶液稳定的因素有两个： 　　（1）水化膜：蛋白质颗粒表面大多为亲水基团，可吸引水分子，使颗粒表面形成一层水化膜，从而阻断蛋白质颗粒的相互聚集，防止溶液中蛋白质的沉淀析出。 　　（2）同种电荷：在pH≠pI的溶液中，蛋白质带有同种电荷。pH＞pI，蛋白质带负电荷；pH＜pI，蛋白质带正电荷。同种电荷相互排斥，阻止蛋白质颗粒相互聚集，发生沉淀。 蛋白质要沉淀必须去掉水化膜和表面电荷。 ; 蛋白质的检测技术一直是与生命科学发展密切相关的前沿课题之一。研究普适性好、灵敏度高且操作简便的蛋白质检测新技术显得越来越迫切。 凯氏定氮法、考马斯亮蓝法。 凯氏定氮法是测定蛋白质含量的经典方法，测试结果比较准确，但是测定需要经过消化、蒸馏、滴定等步骤，操作繁琐，耗费时间长。而且它是通过测定氮含量来推算蛋白质含量。 考马斯亮蓝法以标准蛋白，制作标准曲线的和测定方法用显色剂考马斯亮蓝G-250法快速测定蛋白质。样品的处理方法是，将100 mg 乳粉溶解于1000 mL蒸馏水 ，配成浓度为100 μg/mL蛋白质溶液，然后按要求进行测定。 共振光散射法（Resonance light scattering, RLS）测定蛋白质大分子操作简便、快速、灵敏。 ;光散射的原理;共振光散射现象的发生原因在于当入射光与被测物质的粒子相互作用时，且当入射光的波长接近被测物分子的最大吸收波长时，散射粒子的光散射强度会有所增加。基于此，Pasternack 等首次提出了在普通的荧光光谱仪上，通过调节合适的激发波长和发射波长，建立了共振光散射技术，并利用共振光散射信号的增强值与被测物的浓度在一定范围内呈线性关系，从而被用于痕量物质的定量分析测定。; 测定方法： 基于硫酸铵与蛋白质溶液之间的盐析作用，可以使蛋白质分子凝聚，从而使体系的共振光散射信号增强的现象，提出了一种新的共振光散射探针—硫酸铵，并将其用于牛血清白蛋白（BSA）人血清白蛋白（HAS）和卵清蛋白（OVA）定量测定。同时考察了溶液 pH 值、硫酸铵浓度及干扰离子对检测的影响。最后将本法用于合成样品和实际血清样品中总蛋白的测定，并将结果与传统的考马斯亮蓝（CBB）法得出的结果相比较，发现结果的一致性很好。 ;采用RF 5301 PC型荧光分光光度计，设定激发在220～800 nm波长范围内同步扫描,并根据三种硫酸铵体系的共振光散射谱线，选择最大共振光散射波长为320nm。;光散射测定;光散射测定;理论上讲，蛋白质分子表面所带的静电荷越多，它的溶解度越大，而当外界环境使其表面静电荷为零时，溶解度将达到一个相对的最低值。 当将(NH4)2SO4加入到血清蛋白或卵清蛋白溶液中时，溶液的离子强度发生了变化，导致的蛋白质分子周围电荷数量的降低。 由于此时蛋白质周围电荷数量下降，导致蛋白质的溶解度的下降及大粒子的形成，从而使体系的共振光散射强度增加。综合上述结论，分别选择pH值为3.0, 4.0和3.0作为BSA，HSA和OVA的最优化酸度。;光散射测定;由上图得出结论，分别选择硫酸铵饱和度为60%, 60%和80%作为BSA，HSA和OVA的最优化饱和度。 ;光散射测定;光散射的测定;基于共振光散射现象，提出了一种新的定量测定蛋白质的探针硫酸铵 硫酸铵与蛋白质由于盐析作用，使蛋白质沉淀，从而引起了体系共振光散射强度的增强。 将本法用于合成样品和实际血清样品中总蛋白的测定，并将结果与传统的考马斯亮蓝（CBB）法得出的结果相比较，发现结果的一致性很好。;1光散射测定大分子虽然操作简便，反应灵敏，但也有缺陷。(1)选择性差:由于共振光散射信号反映的是溶液中整体信号，尤其在本体溶液中，被分析物和共存干扰物质的信号很难被区分开来。(2)重现性差，抗干扰能