华中农业大学生理植物过氧化物酶同工酶的测定(凝胶圆盘电泳).pptVIP

实验九--十 植物过氧化物酶同工酶  的测定（凝胶圆盘电泳法） 【实验原理】 以聚丙烯酰胺为支持介质的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）。 聚丙烯酰胺凝胶由丙烯酰胺（Acr）单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成，具有三维网状结构，其网孔大小可由凝胶浓度和交联度加以调节。 【器材与试剂】 （一）材料 小麦芽 （二）仪器设备 稳流稳压电泳仪、冷冻离心机及离心管、 成套电泳槽（圆盘型），pH试纸，其他常规用具 （三） 试剂 1、分离胶缓冲液（pH 8.9） 2、分离胶贮液 3、过硫酸铵溶液 4、浓缩胶缓冲液 5、浓缩胶贮备液 6、电极缓冲液 7、四甲基乙二胺（TEMED） 8、0.1%溴酚蓝溶液 9、联苯胺染色母液 【实验步骤】 （一）过氧化物酶的提取：取8~12粒发芽的麦粒，加入1ml H2O 或0.5mol/L Tris- HCl缓冲液（pH 6.8），冰浴上研成匀浆。 转入离心管，再用2ml上述溶液冲洗研钵壁并全部转入离心管，4000r/min离心10 min，上清液供电泳分析用。 2.点样：取样品50μL，蔗糖－溴酚篮50μL, 混匀，加入玻璃管中。加缓冲液至浸没过玻璃管上端口及电泳槽上盖的电极。排除玻璃管下端口的气泡，连接好电泳仪。 3. 电泳：开始电流为2~3mA/管，当样品至分离胶时，电流加大到4~5mA/管。当溴酚蓝指示剂接近管底时切断电源，终止电泳。 4. 剥胶：取下玻璃管，用装有长针头的注射器沿玻璃管内壁慢慢地边注水边进入，并试着沿玻璃管内壁轻轻转动针头。当胶条松动时，用洗耳球小心地将胶条压出，装于试管中。 （五）记录并计算： 观察、记录酶谱，并计算各同工酶的相对迁移率。 【要点提示】 1. 分离胶聚合时间应控制在30～60min，聚合过快使凝胶太脆易断裂，主要是AP或TEMED过量引起；聚合过慢甚至不聚合，可能是AP或TEMED用量不足或已失效。 2. 电泳时如果电泳槽盖上有冷凝水，则表示电压或电流过大，体系发热，可引起蛋白质变性、凝胶底部断裂等，应注意调整。特别是进入分离胶后应通过控制电压，调节电流不超过5mA/管。 【思考题】 1．说明不连续电泳中的浓缩效应主要是怎样引起的？ 2. 为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和一定浓度的蔗糖溶液？ 3.采用凝胶圆盘电泳法测定过氧化物酶同工酶的原理如何？有什么特色？操作中注意事项有哪些？ * * 生物化学实验之－－ 山东师范大学生命科学学院 【实验目的】 1. 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理； 2. 掌握聚丙烯酰胺凝胶盘状电泳的操作技术； 3. 学习过氧化物酶同工酶的检测方法。 聚丙烯酰胺凝胶结构 PAGE电泳兼有电荷效应和分子筛效应。由于被分离物质所载电荷数量、分子大小和形状的差异，因此在电泳时产生不同的永动速率而相互分离。利用特异性的颜色反应使待测酶着色，这样就可以在凝胶中展现出酶谱。 为了提高聚丙烯酰胺凝胶电泳的分辨率,通常采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，即在分离胶上面加一层浓缩胶，因浓缩胶和分离胶中的离子成分、pH、凝胶浓度不同，电泳开始后，由于浓缩效应,较厚的样品层可以被浓缩的很薄，使电泳具有良好的分辨率。 过氧化物酶是植物体内常见的氧化酶。它能催化H2O2将联苯氨氧化成蓝色或棕褐色产物。因此，将经过电泳后的凝胶置于H2O2-联苯胺溶液中染色，出现蓝色或褐色的部位即为过氧化物酶同工酶在凝胶中存在的位置，多条有色带即构成过氧化物酶同工酶的酶谱。 （二）凝胶的制备 1.准备工作： （1）将一空心橡皮塞套在距玻璃管上端2cm处。 （2）用封口膜封住玻璃管下端至不漏液体。 3.制备小孔胶（分离胶） 取2个小烧杯，按A:C:水:F等于1:2:1:3的比例，分别取A液、C液和水置于一小烧杯中，混匀；F液置另一小烧杯中。将两个小烧杯同时放在真空干燥器中同时抽气5～10min，可见有气泡冒出。 将2个小烧杯内的液体倒在一起轻轻混匀（勿重新带入空气），用滴管先取少量凝胶液加至玻璃管内并甩几下，使液体置于底部，同时注意观察是否漏胶。然后尽快将其它凝胶液装入至达高度距上端口1cm为止。仔细地向表面加一层水以隔绝空气。此时可 见水与胶之间有一界线，但很快消失。 将玻璃管垂直固定在一试管中， 置25～35℃温箱聚合30～60