受体的结构与功能.pptVIP

为保证所制得的膜受体保持良好的结合活性，需注意： ①全部过程在0℃～4℃下进行操作。 ②制备缓冲液的蔗糖密度，离子强度，pH值及其它物质(如EDTA，Mg2+ )应严格控制。 ③组织匀浆条件应保持一致：一般先用高速分散器，后改用玻璃匀浆器将细胞破裂。匀浆的时间、速度、温度应尽量一致。 ④离心的时间、速度、温度应保持恒定。 ⑤为防止膜受体蛋白被蛋白酶水解常加蛋白酶抑制剂。 膜制剂于—70℃可保存数月之久。 三、结合反应的类型 (一)标记配基饱和法(radioligand saturation method)： 它又分为单点饱和及多点饱和法。 1．单点饱和法(single point saturation method)：定量受体制剂加大量的标记配基使受体得以饱和结合。根据受体—配基复合物的放射性计算受体结合容量(或结合位点数)。 这种方法操作简便、标本用量少。但只凭单点实验数据计算受体结合容量，比多点法的结果略低，不能给出KD，误差也较大。 2．多点饱和法(multi－point saturation method)：定量的受体制剂，逐步增加标记配基的量(一般7～8个实验点)，使受体的结合趋于饱和。 用曲线拟合法或直线拟合法计算受结合容量和亲和力(RT、KD)，结果可靠性高。但受体标本、标记配基用量大，工作量大。 如果实验中，受体存在两种亚型，而所选的放射配基对两种亚型又有一定选择性，则得到双位点饱和曲线，用双位点饱和曲线的数学模型可得到两种亚型的RT和KD。 (二)非标记配基饱和法 一定量的受体制剂和标记配基，逐渐增加非标记配基(一般7-8个实验点)，使受体饱和结合，曲线拟合法或直线拟合法计算受体结合容量和亲和力。 这种方法克服了多点饱和法标记配基用量大的缺点，但由于非标记配基的用量逐渐加大，放射性逐步减少，必需标记配基比活度较高才能得到满意结果。 (三)反应速率常数的测定 反应系统中加入定量标记配基及定量受体制剂。于反应开始后不同时间测定特异性结合配基量，可以计算出结合速率常数(k1)。在反应达到平衡后，用大量非标记配基阻断标记配基的结合，发生标记配基单方向的解离，于不同时间测定残存的放射性复合物，可以计算出解离速率常数(k2)。 (四)竞争取代反应 反应系统含定量标记配基、定量受体制剂及逐渐增加的竞争抑制剂。主要目的是测定抑制50％结合的抑制剂浓度(IC50)及抑制剂与受体结合的亲和力(平衡解离常数K1)。 在受体研究领域，这类试验是研究受体与配基结构功能关系的重要方法。 在药物研究领域，则可用来研究药物作用机理、进行药物筛选、发现新药等。 如果所用的标本中受体有两种亚型，实验目的是要区分两种亚型，则必需选无选择性的放射配基和有选择性的竞争剂，此时得到的是双位点竞争取代曲线(dualsite competitive displacement curve)，通过计算机拟合可求得两种亚型的RT、KI及IC50。 四、分析条件的选择 (一)标记配基浓度：单点饱和试验要求饱和量的标记配基。对于多点饱和试验，应尽可能覆盖饱和区及非饱和区，理论上0.1～10KD；实践中应考虑最低一点有足够的放射性满足放射性测量统计上的要求。对于动态试验及竞争结合实验；标记配基浓度一般不能太高，但要满足[LT] ≥[RT]的要求，否则结合反应的假一级速率函数不能成立。KI和IC50的关系也不能成立。 (二)受体浓度：在线性范围内，较高受体浓度，有时可增加特异性结合与非特异性结合的比值。在实践中，不同受体的密度差别很大，往往需要通过实验来确定标本浓度。 (三)温育温度与时间：最佳温育温度要经过试验选定。饱和或竞争取代试验温育时间应足够长以达到平衡状态。测试最佳温育时间时，应用低浓度的放射性配基。温育温度与平衡时间紧密相关， 一般室温操作比较方便(22℃)，但有人认为使用生理温度37℃更好；活细胞的膜受体存在入内化，0℃温育结果的重复性更好。 (四)缓冲液：缓冲液应不干扰结合，并在较大范围内可稳定pH。 结合分析的pH应处于生理范围。钠、镁等离子、蛋白酶抑制剂和非特异结合蛋白要根据具体目的决定选用与否。 五、结合与游离配基的分离 选择适当的分离方法和环境，使受体－配基复合物在分离过程中的解离减少到最低限度。 低温是降低解离的最有效手段，分离快慢也是重要因素。 常用的分离方法有离心法、过滤法、吸附法、透析法、电泳法等。 若复合物解离快，则只能选择快速的分离方法。同时一定要在分离时间，分离温度等方面保持各样品管之间的一致性，以减少误差。 第四节 受体放射分析的数据处理 受体放射分析的数据处理包括两个方面，一是正确的单位换算，二是各种手工或计算机的数据拟合。 一、单点饱和分析法的单位换算 设测得复合物的放射性是2000c