第九章色谱技术.pptx

第九章 色谱技术 生物分离过程的一般流程 原料液 细胞分离(离心，过滤) 细胞－胞内产物 路线一 路线二 细胞破碎 碎片分离 路线一A 路线一B 清液－胞外产物 粗分离(盐析、萃取、超过滤等) 纯化(层析、电泳) 脱盐(凝胶过滤、超过滤) 浓缩(超过滤) 精制(结晶、干燥) 包含体 溶解(加盐酸胍、脲) 复性 目的和要求 了解色谱原理，掌握各种常用色谱方法的操作与应用。 主要讲授内容 一、色谱原理与分类 二、色谱过程理论模型 三、分离度 四、凝胶过滤色谱 五、离子交换色谱 六、疏水性相互作用色谱 七、反相色谱 八、流通色谱 九、置换色谱 十、吸附色谱 十一、分配色谱 一、色谱原理与分类 识记：色谱方法分类 理解：色谱原理 色谱技术 概念：色谱技术是一组相关分离方法的总称，色谱柱的一般结构含有固定相（多孔介质）和流动相，根据物质在两相间的分配行为不同（由于亲和力差异），经过多次分配（吸附-解吸-吸附-解吸…），达到分离的目的。 固定相（stationary phase） 流动相（mobile phase） 1. 定义（chromatograph） 色谱是根据混合物中溶质在互不混溶的两相间分配行为的差别引起移动速度的不同，而进行分离的方法。 2、原理 色谱操作中互不混溶的两相分别称为固定相和流动相。固定相填充于柱内形成固定床，在柱的入口端加入料液后，连续输入流动相，料液中溶质在流动相与固定相之间扩散传质，产生分配平衡 在色谱过程中，分配系数大的溶质在固定相上存在的概率大，随流动相移动速度小。由此，溶质之间由于移动速度的不同而得到分离。 3、色谱分离方法的分类 色谱分离方法很多，种类有四、五十种，但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理分以下几种： 吸附色谱 分配色谱 离子交换色谱 凝胶色谱 （1）流动相分类 气相色谱 液相色谱 超临界色谱 溶剂 色谱泵 自动进样器 HPLC色谱柱 检测器 废液 数据处理系统 （2）固相分类 类型 分配色谱（固定相为液相） 吸附色谱（固定相为固相） 形状 纸色谱 薄层色谱 柱色谱 纸层析 薄层层析 两相溶剂中的一相涂覆在硅胶载体上，作为固定相填充与色谱柱中，另一相与固定相不相混溶，作为流动相。 （3）操作压力分类 低压液相色谱（0.5 MPa） 中压液相色谱（0.5-4.0 MPa） 高压液相色谱（4.0 MPa） （4）流动相流动方式分类 轴向流色谱 径向流色谱 （5）分离操作方式分类 洗脱色谱（洗脱展开）（elution development ） 迎头色谱（frontal analysia） 置换色谱（置换展开）（displacement development） 洗脱色谱（洗脱展开） 料液中的溶质根据其在固定相和流动相（洗脱剂）间的分配行为的不同，在色谱柱出口处被展开形成相互分离的色谱峰。 这种方法能使样品的各组分获得良好的分离，色谱峰清晰。此外，除去冲洗剂后，可获得纯度较高的物质。目前，这种方法是色谱法中最常用的一种方法。 迎头分析法 迎头分析法与一般的固定床吸附操作相同，大量的料液连续输入到色谱柱中，直到在出口处发生溶质穿透。 迎头分析中各溶质按其在固定相和流动相间分配系数的大小次序穿透，因此，只有最先穿透的（分配系数最小）组分能以纯的状态得到部分回收。 该法在分离多组分混合物时，除第一组分外，其余均非纯态，因此仅适用于从含有微量杂质的混合物中切割出一个高纯组分（组分A），而不适用于对混合物进行分离。 置换展开 置换展开即置换色谱，与普通的洗脱色谱所不同的是，置换色谱所采用的洗脱液（流动相）中含有与固定相的亲和作用比料液中的各个组分都要大的物质（置换剂）。它将料液中所含溶质按其与固定相亲和力的大小不同，从固定相上依次置换（洗脱）下来，彼此得以分离。 此法适于制备纯物质或浓缩分离某一组分；其缺点是经一次使用后，柱子就被样品或顶替剂饱和，必须更换柱子或除去被柱子吸附的物质后，才能再使用。 （6）机理分类 凝胶过滤色谱 离子交换色谱 反相色谱 疏水性相互作用色谱 亲和色谱 （7）色谱流出曲线及有关术语 （一）色谱流出曲线和色谱峰 由检测器输出的信号强度对时间作图，所得曲线称为色谱流出曲线。曲线上突起部分就是色谱峰。 如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线（气固吸附色谱）或分配等温线（气液分配色谱）的线性范围内，则色谱峰是对称的。 （二）基线 在实验操作条件下，色谱柱后没有样品组分流出时的流出曲线称为基线，稳定的基线应该是一条水平直线。 （三）峰高 色谱峰顶点与基线之间的垂直距离，以（h）表示。