品种纯度室内测定.pptVIP

六、电泳操作 样品提取 按GB/T3543.2的要求，从送验样品中随机数取（或分取）玉米种子至少100粒，单粒粉碎,放入1.5ml离心管,加与样品相同体积的样品提取液,摇匀,放置5-10min,再摇匀,30min后，用离心机离心（5000r/min）15min,取上清液电泳. 凝胶制备 胶室制备 将玻璃板装入胶条中，把胶条固定在电泳槽内，保持水平，短板向正极，拧紧备用。 封底缝 取适量分离胶溶液于烧杯中，加入适量3%的过氧化氢溶液，迅速摇匀，并从长玻璃外侧沿玻璃板倒入，振动电泳槽3次，静置。 灌分离胶 底缝封好后，取适量分离胶溶液，加入适量3%的过氧化氢溶液，迅速摇匀，将分离胶溶液倒入两玻璃之间，高度距短玻璃上沿1.2cm，迅速用适量的正丁醇封住胶面。待凝胶聚合后，用去离子水冲洗胶面3次，用滤纸吸干。灌浓缩胶 取适量浓离胶溶液，加入适量3%的过氧化氢溶液，迅速摇匀，倒入两玻璃之间，马上插好样品梳。 点样 浓缩胶聚合后，拔出样品梳并清理样品槽，用微量进样器在每个样品槽中加入不同籽粒的样品上清液15ul，每点一粒后，用去离子水清洗进样器3次。点样时要注意，定量均匀，不要有气泡。上样前最好将样品先离心，否则造成电泳中常见的拖尾现象。 电泳 加样完毕后，倒入电极缓冲液，上槽电极液要高于短玻璃，下槽电极液要高于电极丝；将电源线正极接上槽，负极接下槽；接通电源，采用500V稳压进行电泳，待甲基绿指示剂下移至胶底部边缘时，关闭电源。 染色观察 取出胶片，在30℃恒温条件下染色2-4h；观察。 七、结果计算 电泳测定值 计数供检样品粒数和非本品种粒数,按下式计算电泳测定值 样品纯度值计算 将电泳测定值X代入回归方程，计算出样品纯度值，将电泳纯度值与GB4404.1中的纯度值进行比较判定样品是否合格。 电泳中易出现的问题及对策 1、凝胶聚合不好 通常凝胶聚合应该在15-30分钟。过快聚合表示催化剂用量太多，此时凝胶太硬易龟裂，且在电泳时易烧胶。聚合太慢，甚至不聚合，表示试剂配比不对，凝胶液放置时间过长，试剂不纯，温度偏低。 2、分离胶不平整或凝胶内产生气泡 灌好分离胶之后没有加入正丁醇；灌胶速度太快。 3、电泳过程中不正常现象及对策 ①电源上没有显示电压，说明电源故障或电极丝断了。 ②前沿指示剂向相反方向移动，说明电源连接正、负极措置或缓冲液选择错误。 ③凝胶龟裂或与玻板分离，这主要是电流过大胶板过热造成的。 ④谱带分离效果不好，大分子蛋白分离不好，凝胶浓度过高；小分子蛋白分离不好，凝胶浓度过低。 ⑤电泳时间太短。谱带不整齐，主要是凝胶聚合太快，分离胶面不平或凝胶内有气泡。⑥指示剂前沿呈现两边向上的曲线，即“笑脸”现象，说明凝胶冷却不均匀，中间部分冷却不好。如果指示剂前沿呈现两边向下的曲线，即“皱眉”现象，则常常是由于电泳槽装置不合适引起的，比如底部有气泡或凝胶聚合不均匀。 * （2）国际植物新品种保护联盟于1994年制订有关电泳技术标准将分析小麦高分子量麦谷蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、分析大麦醇溶蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、分析大麦醇溶蛋白的酸性聚丙烯酰胺凝胶电泳方法、分析玉米同工酶的淀粉凝胶电泳方法列入DUS检测应用。 （3）我国GB/T 3543农作物种子检验规程已将ISTA规程的鉴定小麦和大麦品种的聚丙烯酰胺凝胶电泳标准参照方法列入应用。2001年农业部颁布了“玉米种子纯度盐溶蛋白电泳鉴定方法”（NY/T449－2001）。 二、电泳法测定品种纯度的原理 （一）电泳法测定品种纯度的遗传基础 电泳法测定品种纯度主要利用电泳技术对品种的同工酶及蛋白质的组分进行分析，找出品种间差异的生化和分子指标，以此区分不同品种。 目前品种鉴定主要以同工酶和蛋白质为电泳对象。同工酶是指同一生物体或同一组织中催化相同化学反应，结构不同的一类酶。从遗传法则（DNA→RNA→蛋白质（或酶））知道，蛋白质或酶组分的差异最终是由于品种遗传基础的差异造成的，因此分析酶及蛋白质的差异从本质上说是分析遗传的差异，即品种差异， 利用先进的电泳技术可非常准确地分析种子蛋白质或同工酶的差异，进而区分不同品种，测定品种纯度。 由于某些同工酶在种子贮藏和萌发过程中，种类数目易随生活力和发育进程的变化而变化，加之种子萌发速度不一致，所以对品种纯度鉴定不利。此外，酶的提取和电泳条件较蛋白质要求严格，需在低温下进行。因此，在纯度鉴定的研究中，应以蛋白质为主。 （二）聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理 聚丙烯酰胺凝胶是聚丙烯酰胺通过交联剂（甲叉双丙烯酰胺，Bis）在催化剂的作用下聚合成的高分子胶状聚合物。其凝胶透明