噬菌体和柯斯质粒.pptVIP

第三章 噬菌体和柯斯质粒 引　　言 噬菌体是一类细菌病毒的简称，英文名为Bacteriophage（简称phage），指吞噬之意，其结构与细菌和真核细胞相比，十分简单，但又比质粒DNA要复杂，不仅有复制起点，还有编码外壳的蛋白质基因。 噬菌体的一般生物学特性 依赖于寄主细胞存活。脱离了寄主细胞后既不能生长也不能复制。 基本功能： 保护自己的核酸分子（DNA或RNA）免遭环境化学物质的破坏 将其核酸分子注入到被感染的细菌细胞 经被感染的细菌细胞转变成制造噬菌体的体系，从而能产生出大量的子代噬菌体颗粒。 使感染的细菌细胞释放出子代噬菌体颗粒 噬菌体的结构及其核酸类型 不同种类的噬菌体颗粒，在结构上有很大差别。 三种不同基本类型： 　无尾部的二十面体型 　具尾部的二十面体型（大多数噬菌的构形） 　线状体型 噬菌体的核酸： 双链线性DNA（最常见） 双链环形DNA 单链环形DNA 单链线性DNA 单链RNA 噬菌体的生命周期 溶菌周期的基本特征 吸附：噬菌体颗粒吸附到位于感染细胞表面的特殊接收器上。 注入：噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞。 转变：被感染的细菌细胞的功能发生变化，成为制造噬菌体颗粒的场所。 合成：功能发生了转变的寄主细胞大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质。 组装：包装了DNA的头部和尾部组装成噬菌体的颗粒，这个过程也叫做噬菌体的形态建成。 释放：新合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来。 t=0 噬菌体吸附到寄主菌的细胞壁，大约在吸附的2秒钟内就会发生噬菌体DNA的注入； t=1 寄主DNA、RNA和蛋白质的合成反应被全部关闭； t=2 第一个噬菌体mRNA开始合成； t=3 细菌DNA开始降解； t=5 噬菌体DNA合成开始启动； t=9 “晚期”噬菌体mRNA开始合成； t=12 出现完整的头部和尾部结构； t=15 出现头一个完整的噬菌体颗粒； t=22 细菌发生溶菌作用，释放出约300个左右的噬菌体颗粒 溶源生命周期 基本概念： 温和噬菌体（temperate phage）：既能进入溶菌生命周期，又能进入溶源生命周期的噬菌体。 溶源性细菌（lysogen）：具有一套完整的噬菌体基因组的细菌，如果某些噬菌体基因缺失了，那么这样的噬菌体就不能完成其溶菌周期，故含有这种噬菌体的细菌叫缺陷型的溶源性细菌。 溶源化：用温和的噬菌体感染细菌培养物使之成为温和性噬菌体的过程。 整合：如果噬菌体的DNA是被包容在寄主细菌染色体DNA中，叫做已整合的噬菌体DNA。这种噬菌体DNA进入细菌染色体DNA的过程，称为噬菌体DNA的整合或插入。以游离DNA分子形式存在的噬菌体DNA叫做非整合的噬菌体DNA。 原噬菌体：在溶源性细菌内存在的整合的或非整合的噬菌体DNＡ。 超感染免疫性 定义：溶源性的细菌不能被头一次感染并使之溶源化的同种噬菌体再感染，溶源性细菌所具有的这种抗御同种噬菌体再感染的特性，叫做超感染免疫性。 超感染免疫性是由一种阻遏-操纵体系所控制的。阻遏基因cI编码的阻遏蛋白，与两个分别同启动基因PL和PR相邻的操纵基因OL和OR结合。 溶源噬菌体的诱发 也依赖于阻遏基因和操纵基因的相互作用，只要在溶源性细菌中的阻遏基因是处于失活状态，那么λ噬菌体的操纵基因就会自由转录。 需要合成一种删除酶（excisionase）噬菌体产物。功能是将原噬菌体DNA从细菌染色体DNA上删除下来，而后环化形成环形的DNA分子。 插入机理的Campbell模型 重组噬菌体的分离 第二节 λ噬菌体载体 λ噬菌体载体 1 λ噬菌体的分子生物学概述 2 λ噬菌体载体 λ噬菌体基因组编码基因区域 左侧区：自基因A到基因J，包括参与噬菌体头部蛋白质和尾部蛋白质合成所需要的全部基因。 中间区：介于基因J与基因N之间，这个区又称为非必要区。本区基因与保持噬菌斑形成能力无关，但包括了一些与重组有关的基因（redA 和redB）。以及整合到大肠杆菌染色体中去的int基因。和把原噬菌体从寄主染色体上删除出去的xis基因。 右侧区：位于Ｎ基因的右侧，包括全部主要的调控成分，噬菌体复制基因（Ｏ和Ｐ）以及溶菌基因（Ｓ和Ｒ） 注 意 λ噬菌体感染了寄主细胞之后，究竟是发生溶菌反应还是溶源反应，这是由cI基因和cro基因编码的蛋白质，同λ噬菌体的两个操纵基因（OL, OR)之间的相互作用来决定的。 如果这两个操纵基因都已摆脱了阻遏状态，那么噬菌体便可以进入溶菌周期，否则进行溶源周期。 λ噬菌体载体的构建及主要类型 构建λ噬菌体载体的基本原理 野生型的λ噬菌体DNA，对大多数基因克隆中常用的核酸内切酶都有过多的限制位点，通过消除一些多余的限制位点和切除非必要的区段，才可能将它改造成适用的克隆载体。