疏水层析相互作用.pptVIP

疏水作用层析Hydrophobic Interaction ChromatographyHIC ;一、疏水层析的概念及原理;　　; 高浓度盐与水分子发生强烈作用，导致疏水分子周围形成空穴的水分子减少，促进疏水性分子与介质的疏水配基之间发生结合 ;疏水相互作用 的机制;二、疏水层析过程;（一）、介质（基质+配基）的选择; HIC介质的疏水配基主要为烷基和芳香基，与反相层析介质相比，其烷基通常在C8以下，芳香基多为苯基 。 ;偶联至基质的常见配基类型 （A）丁基，（B）辛基，（C）苯基，（D）新戊基 ; 对某些蛋白而言，上述有些配基与其结合力太强，为洗脱有时需用有机溶剂，有变性风险；具中等疏水的高分子配基(如聚乙二醇和聚丙二醇等)不仅可提供足够的结合力，且避免了上述缺点。;常用的疏水层析介质;⒊ Phenyl Sepharose 6 Fast Flow(苯基琼脂糖凝胶4FF) 疏水性最强，载量高，适合含芳香族配体的生物分子的预处理，载量为每ml 填料结合40 umol苯基 ，工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是600cm/h 。 ⒋ Phenyl Sepharose CL-4B(苯基琼脂糖凝胶CL-4B) 疏水性较Octyl弱，适用于分离和纯化对疏水性尚未了解的蛋白，载量为每ml填料结合 40 umol苯基；工作pH范围为3-13，清洗pH范围为2-14，工作的最大速度是50cm/h 。 ;在HIC中，应选机械强度较大的刚性基质；若待分离物质分子量很大，且样品量较大，则应选大孔基质，如琼脂糖凝胶；若待分离物质较小，或样品量很小，但分辨率的要求高，则可选孔径小的基质甚至非孔型基质。 HIC介质中，烷基配基的链长大多在C4～C8之间，苯基的疏水性大致与戊基相当，因与溶质发生π-π相互作用，它与戊基有不同的选择性，而寡聚乙二醇固定相的疏水性介于丁基与苯基之间 。;不同的介质对同一样品有不同的分离效果：;填料的筛选试验; 预装柱筛选法;6.上完样后以1ml/min的流速，继续用平衡缓冲液冲洗直到紫外、电导基线平稳（至少5个CV），过程中收集洗脱物。 7.用洗脱缓冲液以1ml/min的流速进行洗脱，洗3-5个CV，收集洗脱峰。 8.检测每一个预装柱洗脱下来的洗脱峰的纯度及含量。;基本原理 硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制??中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球蛋白从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。;实验过程;（三）、 层析条件的优化; 疏水层析缓冲液中的pH对整个分离的影响不大，一般调至中性（6－8）左右.溶液的pH值主要考虑能维持生物大分子生物活性的pH环境，而且蛋白质结合疏水填料的能力一般在 pH 6-8 下没有什么变化。当溶液的pH接近蛋白质的等电点时，其疏水性增加，有利于与配基结合。（若缓冲液的PH为蛋白的PI，则蛋白易发生沉淀）;缓冲体系的选择; 如同填料选择一样，疏水相互作用层析中盐的选择也是不断尝试的过程，因为每种盐在促进疏水相互作用方面的能力都不同，随着盐浓度的增加，结合的蛋白几乎随着线性增加，直到一个特殊的盐浓度，然后随着盐浓度的增加，结合的蛋白呈指数形式增加 在实践中，钠、钾或铵的硫酸盐具有有效的促进了疏水相互作用层析中配基和蛋白的相互作用，并且对蛋白结构具有稳定作用。因此，最通常使用的盐是硫酸铵、硫酸钠、氯化钠、氯化钾和醋酸铵。 ;下图显示的是不同的盐如何影响选择性的. 按出峰顺序依次为：细胞色素C、溶菌酶、核糖核酸酶A，ａ-糜蛋白酶原;3.离子强度的选择;离子强度确定方法;预装 柱法;4.洗脱方式的选择;（2）逐步洗脱：;5.其他;根据分离阶段的不同，流速也不一样。如在平衡、洗涤、再平衡的过程中可以稍微提高流速；在上样和线性洗脱或时建议使用低流速，以免流穿或分离不开。 ;三、应用;牛皮层骨中纯化酸性磷酸酶 ：;钙调蛋白纯化过程;疏水作用层析法纯化抗乙肝病毒核心抗原单克隆抗体; 近年来，随着层析技术的发展，与HIC相关的其它层析技术也得到了发展，主要有以下两种： 1）亲硫性疏水层析 (thio—philic chromatography) 2）疏水电荷诱导层析 (HCI