大鼠抗核膜糖蛋白.pdf

大鼠抗核膜糖蛋白210 抗体（gp210）酶联免疫分析 试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 预期应用 ELISA 法定量测定大鼠血清、血浆或其它相关液体中抗核膜糖蛋白210 抗体（gp210）含量。 实验原理 本试剂盒应用双抗体夹心酶标免疫分析法测定标本中gp210 Ab水平。用纯化的抗体包被微 孔板，制成固相抗体，往包被单抗的微孔中依次加入gp210 Ab抗原、生物素化的抗大鼠gp210 Ab 抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物TMB 显色。TMB在过氧化物酶的催 化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的gp210 Ab 呈 正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1.酶联板：一块（96 孔） 2.标准品（冻干品）：2瓶，每瓶临用前以样品稀释液稀释至1ml，盖好后静置10 分钟以 上，然后反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为500 ng/ml，做系列倍比稀释后，分别稀释250 ng/ml，125 ng/ml，62.5 ng/ml，31.2 ng/ml，15.6 ng/ml，7.8ng/ml，3.9ng/ml，样品稀释液 直接作为标准浓度0ng/ml，临用前15 分钟内配制。 如配制250 ng/ml 标准品：取0.5ml 500 ng/ml 的上述标准品加入含有0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3.样品稀释液：1×20ml/瓶。 4.检测稀释液A：1×10ml/瓶。 5.检测稀释液B：1×10ml/瓶。 6.检测溶液A：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液A 1:100 稀释，稀释前根据预先计 算好的每次实验所需的总量配制（每孔100ul），实际配制时应多配制0.1-0.2ml。如1ul 检 测溶液A 加99ul 检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制。 7.检测溶液B：1×120ul/瓶（1:100）临用前以检测稀释液B1:100 稀释。稀释方法同检测溶 液A。 8.底物溶液：1×10ml/瓶。 9.浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10. 终止液：1×10ml/瓶（2N H2SO4）。 标本的采集及保存 1. 细胞培养物上清：请离心后收集上清，并将标本保存于-20℃，且应避免反复冻融。 2. 血清：标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000 xg 离心20 分钟，取上清即可检测， 或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 3. 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30 分钟内于2 - 8°C1000 x g离心15 分钟，或将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融。 注：标本溶血会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 操作步骤 实验开始前，请提前配置好所有试剂，试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。 每次检测都应该做标准曲线。如样品浓度过高时，用样品稀释液进行稀释，以使样品符合试 剂盒的检测范围。 1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100ul，余孔分别加标 准品或待测样品100ul，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁， 轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120 分钟。 为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。 2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A 工作液 100ul（取1ul 检测溶液A 加99ul 检测稀释液A的比例配制，轻轻混匀，在使用前一小时内配制），37℃,60分钟。 3.温育60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3 次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干 （也可轻拍将孔内液体拍干）。 4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A 工作液） 100ul，37℃，60 分钟。 5.温育60 分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5 次，每次浸泡1-2分钟，350ul/每孔，甩干 （也可轻拍将孔内液体拍干）。 6.依序每孔加底物溶液90ul，37℃避光显色（30 分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4 孔 有明显的梯度兰色，后3-4 孔梯度不明显，即可终止）。 7.依序每孔加终止溶液50ul，终止反应（此时蓝色立转黄色）。终止液的加入顺序应尽量与 底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。 8.用酶联仪在450nm 波长依序测量各孔的光密度（OD 值）。 在加终止液后15 分钟以内进 行检测。 注： 1.每次实验留一孔作为空白调零孔，该孔不加任何试剂，只是