人多能干细胞向胰腺β细胞和神经细胞定向分化的机制研究精选.doc

项目名称： 人多能干细胞向胰腺β细胞和神经细胞定向分化的机制研究 起止年限： 2012.1至2016.8 教育部  目前人多能干细胞定向分化尚未在“功能成熟”和“分化效率”两个难点上取得突破。基于我们已经建立的稳定体外分化体系，我们认为解决这两个问题的一个关键点在于对分化过程中的干/祖细胞的特化、形成阶段和终末功能细胞成熟阶段的分子调控网络开展系统性研究。干/祖细胞具有扩增并能进一步分化为成熟功能细胞的能力，了解干/祖细胞的产生机制，并扩增和富集干/祖细胞，进而提高分化效率，将为下一步研究终末分化细胞的成熟机制打下重要基础。终末功能细胞成熟阶段则直接关系到终末细胞的功能是否完全。因此我们认为需要在这两个阶段寻找促进干/祖细胞特化、产生和扩增以及终末功能细胞成熟的关键因子，并深入分析其分子调控机理。 解决这两个问题的另外一个关键点在于分析人体内胚胎期细胞分化和成熟过程相对模式生物的独特性，为人多能干细胞体外分化提供新的线索。体外定向分化体系的建立主要依据对体内胚胎期细胞分化和功能成熟的调控机制的研究，但是目前人多能干细胞定向分化主要参考小鼠等模式生物的发育机制研究，而根据这些模式生物的发育机制指导人多能干细胞定向分化存在很大的局限性：一方面种属差异造成人细胞分化和功能成熟具有其独特性，另一方面人胚胎发育时程较其他模式生物更长，发育过程中人体细胞分化和功能成熟的机制比其他模式生物更为复杂。因此，要解决目前体外分化中一系列问题，需要深入研究人体内胚胎期细胞分化和功能成熟的过程，以及该过程相比其他模式生物的独特性。 综上所述，结合我们团队在人多能干细胞向胰腺β细胞和神经细胞定向分化上的工作基础，本项目提出以下关键科学问题：1）体外分化体系中促进胰腺干/祖细胞和神经干/祖细胞特化、产生的关键因子是什么？这些关键因子是如何被调控的？2）体外分化体系中促进胰腺β细胞产生和功能成熟的关键因子是什么？这些关键因子是如何被调控的？3）体外分化体系中终末神经元的生理功能是如何获得的？4）人体内胚胎期胰腺β细胞及神经细胞的分化和功能成熟过程相对模式生物有何独特性？如何借鉴这种独特性来为人多能干细胞向胰腺β细胞及神经细胞定向分化寻找新的线索？ （二） 主要研究内容 围绕上述关键科学问题，本项目的主要研究包括四个方面： 1.人多能干细胞向胰腺β细胞定向分化的机制研究 基于我们已建立的稳定的人多能干细胞向胰腺β细胞定向分化体系，从mRNA、蛋白表达、表观遗传学等多个水平分析目前体外分化体系中胰腺干/祖细胞、胰腺β细胞的基因调控网络，以分析目前分化体系的关键缺陷。根据这些线索，进一步寻找促进胰腺干/祖细胞形成的关键因子以及促进胰腺β细胞形成和功能成熟的关键因子，进而阐明这些关键因子的分子调控机制。此外，由于胰腺属于内胚层器官，其干祖细胞早期特化过程的关键调控信号通路与其他内胚层器官如肝脏、胸腺等相比必然有其特异性。我们将系统比较在内胚层发育过程中，胰腺干/祖细胞早期命运决定的关键信号通路与其它内胚层组织细胞的异同，从而寻找特异性调控胰腺干/祖细胞前期特化的关键因子和相关信号通路。 2.分析人胰腺β细胞分化和功能成熟途径的独特性 一方面，通过分析人体内胚胎期从胰腺开始形成到胰腺β细胞功能成熟的过程中不同阶段的胚胎胰腺样本，来系统地分析描绘人体内胚胎期胰腺β细胞的分化和功能成熟过程，为体外人多能干细胞向胰腺β细胞定向分化提供重要参考；在此基础上，我们还将系统分析内胚层其他器官如肝脏等胚胎期的样本，寻找其特化与发育的关键转录因子和信号通路，并比较其与胰腺组织特化的差异，从而分析人胰腺细胞发育过程的独特性。 另一方面，在胰腺干/祖细胞形成阶段、胰腺β细胞成熟阶段，从基因表达、表观遗传学等多个角度系统分析胰腺发育过程中的关键调控基因的表达模式，并与模式生物胰腺发育过程相应基因的表达模式进行比较分析，以揭示人体内胚胎期胰腺β细胞分化和功能成熟过程的独特性。同时分离人体内胚胎期胰腺β细胞分化和成熟过程中不同阶段的细胞，利用我们已建立的分化细胞体内功能成熟体系研究人体内胰腺β细胞功能成熟过程，并与模式生物β细胞功能成熟过程比较，分析其独特性。根据这些独特性，在体外分化体系中进一步寻找促进胰腺β细胞分化和功能成熟的关键因子，并研究其调控机制。 3.人多能干细胞向神经细胞分化中早期特化分子机理的研究 采用我们近期建立的人多能干细胞向神经细胞早期分化的高效模型，运用转录组测序和甲基化DNA免疫共沉淀测序技术（MeDIP-seq）检测人多能干细胞向神经细胞早期分化过程中的时空显著变化基因和甲基化修饰变化图谱，分析早期神经分化过程中的关键调控网络。同时，采用人类激酶基因组（kinome） shRNA干扰文库在人多能干细胞向神经细胞早期分化过程中进行功能筛