QBHHS JC003-2013 发酵豆粕中抗原蛋白的定性检测办法.pdf

编号：QB/HHS JC003-2013 检测技术规范与标准方法 修订：第 1 版 第2次修改 起草：赵丽霞 审核：刘永垒 发酵豆粕中抗原蛋白的定性检测办法 批准： 执行日期：2013年06月15 日 1 检测办法 SDS法 2 原理 十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis,SDS)的主要用途是分离蛋白质和测定其亚基的分子质量。SDS-聚丙烯酰 胺凝胶为网状结构，具有分子筛效应。在电泳的过程中，能根据蛋白质亚基分子量的不同而逐渐 呈梯度分开蛋白质。 3 仪器 3.1 DYCZ-24EN双垂直电泳仪（基本参数：外型尺寸（L×W×D）：190×120×170mm； 3.2 凝胶板：规格(L×W)：130×100mm； 3.3 试样格：12齿，1.0mm厚； 3.4 电泳槽：能容纳2Kg缓冲液，总容量约1200mL； 3.5 DYY-8C双稳定时电泳仪电源（基本参数：并联输出：2组；输出范围（显示分辨率）：5-600V(1V) 2-200mA(1mA) 120W；外形尺寸（W×D×H）：315×290×128 mm；重量：约5Kg）； 3.6 移液枪(5mL, 1000μL, 100μL, 20μL)以及其配套枪头； 3.7 100℃沸水浴装置； 3.8 带盖塑料染色盒； 3.9 脱色摇床。 4 试剂 4.1 制胶试剂： 丙烯酰胺（电泳级）； N，N-甲叉双丙烯酰胺； Tris碱；  SDS； N,N,N,N-四甲基乙二胺（TEMED）； 过硫酸铵； DTT或β-巯基乙醇； 甘油； 溴酚蓝； 甘氨酸； 盐酸。 4.2 染色/脱色试剂： 考马斯亮蓝R-250； 甲醇； 冰醋酸。 4.3 储存液： 4.3.1 30％丙烯酰胺储存液：29.2g丙烯酰胺，0.8g双丙烯酰胺，加去离子水至100mL，储存于 棕色瓶中，4℃保存 1个月左右。（注意：未聚合的丙烯酰胺有神经毒性，须在通风橱内小心操作）。 4.3.2 分离胶缓冲液 （1.5mol/LTris-HCl，pH8.8）：18.15gTris，加入约80mL重蒸水，用1mol/L 的HCl调pH到8.8，用重蒸水定容至最终体积100mL，4℃冰箱保存备用。 4.3.3 浓缩胶缓冲液（0.5mol/L Tris-HCl，pH6.8）：6gTris，加入约60mL重蒸水，用1mol/L 的HCl调pH到6.8，用重蒸水定容至最终体积100mL，4℃冰箱保存备用。 4.3.4 10% 过硫酸铵： 0.5g过硫酸铵， 加5mL蒸馏水，新鲜配置，-20℃保存一个月左右。 4.3.5 10% （w/v）SDS：10g SDS加蒸馏水100mL，室温保存。 4.3.6 2×上样缓冲液（10mL）：2.5mL 0.5mol/L Tris-HCL (pH6.8)，2mL甘油，4mL 10% SDS， β-巯基乙醇 1mL，0.5mL 1%溴酚蓝，可在4℃存放数周，或在-20℃保存数月。 4.3.7 电泳缓冲液（1L）：3.0g Tris碱，14.4g甘氨酸（电泳级），SDS1.0g，加蒸馏水至1L，4 ℃冰箱保存。 4.3.8 固定液(1000mL)：甲醇450ml，冰乙酸，100ml，蒸馏水450ml 4.3.9 考马斯亮蓝染色液：1.0g考马斯亮蓝R-250，450mL 甲醇，100mL冰醋酸，450mL蒸馏水 定容至1000mL。 4.3.10 考马斯亮蓝脱色液：100mL甲醇，100mL冰醋酸，800mL蒸馏水。 4.3.11 提取液：取3.63gTris，加1000ml水溶解，加0.7mlβ-巯基乙醇，用盐酸调pH至8.0。 5 实验方法与步骤 5.1 分离胶的配制： 根据蛋白质分子量的大小，选择分离胶浓度12%