酶的定向进化技术研究进展.doc

酶的定向进化技术研究进展 摘 要 关键词：， 由于酶的应用广泛，酶的提取和合成就成了重要的研究课题。然而，就目前从自然界中发现和鉴定的几千种酶来说，真正能够进行大规模生产和应用的商品酶却不多。大量的天然酶尚无法被提取或合成出来，从而在复杂的工业生产环境中得到应用。此外，应用于工业生产环境的酶的催化反应条件通常为高温、高压、极端pH、高盐及存在有机溶剂、含有去污剂或氧化剂等极端环境，而天然酶在这些极端工业生产环境中的性质发生了很大变化，甚至变性失活，难以满足工业催化的要求。因此需要获得具有新功能和特性的酶。 定向进化技术出现以前获得具有新功能和特性的酶的途径通常为：一是在自然界中寻找，但是由于不具有针对性，很难有满意的结果；二是利用定点突变技术改造现有的酶，但是定点突变技术只能对现有的酶的少数氨基酸进行替换、删除或插入，无法改变酶蛋白的高级结构，对酶的改造有限。 定向进化技术可以人为地改变天然生物催化剂的某些性质，从而为酶的公寓应用提供了有效的工具，为新酶的发现提供了新的途径，创造了新的机会。该技术可在实验室中模拟自然选择过程来达到酶进化的目的，将酶在自然界需要几百万年才能完成的进化过程缩短到几年、几个月甚至更短，加速了酶的进化过程，增强在不良环境中的稳定性，甚至创造出新酶种类[2-5]。 1 酶的定向进化的定义 酶的定向进化是指在不需要事先了解酶的空间结构和酶的催化机制的条件下，通过各种突变方法向编码酶蛋白的基因中引入突变，突变的基因可以通过重组如DNA改组等方法进行重新组装，提高基因进化的效率。这些被改造的基因可以编码具有新特性的酶蛋白，得到酶蛋白突变文库，再利用筛选或选择的方法在酶蛋白突变文库中获得具有目的性能的突变株。 2 酶的定向进化的原理 定向进化是利用Taq DNA 多聚酶不具有3→5校对功能的性质，并结合基因工程现有技术手段，在待进化酶基因的PCR 扩增反应中，配合适当条件，以很低的比率向目的基因中随机引入突变，并构建突变库。凭借定向的选择方法，选出所需性质优化的酶，从而排除其他突变体。 定向进化的基本规则是：“获取所筛选的突变体”。简言之，定向进化就是随机突变同选择或筛选相结合。与自然进化不同，定向进化是受人为控制的，起着选择某一方向的进化而除掉其他方向突变的作用，整个进化过程完全是在人为条件控制下进行的[6]。 3 酶的定向进化的方法 定向进化包括两个基本步骤:(1)构建目的酶蛋白的突变体库；(2)对不同突变基因表达的酶蛋白进行筛选，找到目标突变体。 3.1 构建目的酶蛋白的突变体库 目前，构建目的酶蛋白的突变体库的主要方法有易错PCR、DNA Shuffling、随机引物体外重组法、交错延伸重组法、 3.1.1 易错PCR 易错PCR 是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，来改变扩增过程中的突变频率，从而以一定的频率向目的基因中随机引入突变，获得蛋白质分子的随机突变体。 其关键在于对合适突变频率的选择，突变频率太高会导致绝大多数突变为有害突变，无法筛选到有益突变;突变频率太低则会导致文库中全是野生型群体。理想的碱基置换率和易错的最佳条件主要依赖于突变的DNA片段的长度。 为改变细胞色素CYP102A2的催化活性，Axarli 和 Labrou 采用易错PCR对其进行定向进化实验, ,构建突变体库，通过活力测定筛选突变体。实验得到的CYP102A2突变体（Pro15Ser）的酶活性明显加强,并且其底物是一系列的芳香族和脂肪族[7]。 3.1.2 DNA Shuffling 1994年，Stemmer等首先发表了第一篇题为“用DNA 改组技术体外快速进化蛋白”的论文，一种崭新的定向分子进化新技术——DNA shuffling在美国Affymax研究所的Stemmer实验室悄然出现。该技术在试管里模拟达尔文进化的过程，在分子水平上创造分子的多样性（molecular diversity），结合灵敏的筛选技术，迅速得到理想的变异[8]。 DNA shuffling DNA shuffling的步骤如上图所示：首先对一组序列（经随机诱变得到的一组有益突变体，或天然存在的基因家族），经过超声波处理或用DNA酶I(DNase I)消化产生一系列随机切割的DNA片段，然后，在没有引物的情况下，采用有性PCR方法进行合成。随着循环数的增加， PCR产物将越来越接近切割前的目的基因的长度。最后，用基因两侧的引物合成全长的基因。该基因已经包含了不同突变体发生的突变。再加入基因的两端引物进行常规PCR,最终获得发生改组的基因库[9]。 DNA shuffling技术由多个亲本参与到定向进化过程中，引入了重组、缺失、重复等多