基因工程次重点.doc

第一章 生物技术的特点：高效益、高智力、高投入、搞竞争、高风险、高势能 高新技术：生物技术、信息技术、新材料技术、新能源技术、空间技术、海洋技术 基因工程三大基本元件：供体、受体、载体 基因工程的理论依据：1.不同基因具有相同的物质基础2.基因是可切割的3.基因是可以转移的4.多肽和基因之间存在对应5.遗传密码是通用的6。基因可通过复制把遗传信息传给下一代 基因工程原理的三大基石：分子遗传学、分子生物学、生物化学工程学 基因工程的支撑技术：核酸凝胶电泳技术、核酸分子杂交技术、细菌转化转染技术、DNA序列分析技术、寡核苷酸合成技术、基因定点突变技术、聚合酶链反应技术 第一个被发现并应用的限制性核酸内切酶：Hind II 基因工程诞生时间（建立DNA重组技术）：1973-Cohen Boyer 第一个基因工程药物：人生长激素释放抑制激素（基因工程成熟阶段） 第一个基因工程药物上市：重组人胰岛素 第一个转基因动物：超级硕鼠 第一个转基因植物：转基因烟草 第一个基因工程疫苗：乙肝疫苗 第一个单克隆抗体药物：抗CD3单抗OKT3 第二章 II型限制酶主要特性：单功能、同源二聚体、Mg2+、4-6bp旋转对称回文结构、识别序列内或两侧特异性切割 限制酶识别序列出现的频率：n碱基对的识别序列在DNA上出现的频率为1/4n 题1：Dpn I识别序列为GATC，其在DNA上出现的频率为1/44，即任何一个DNA分子上，平均每256bp中就会出现1个Dpn I切口。 识别序列为4、5、6碱基对的II型酶分别有20、30、50种。 题2：DNA链上出现1个II型酶识别序列的概率约为1/9（20×1/44+ 30×1/45+ 50×1/46），即任何1个DNA分子上，平均每9bp中就会出现1个II型酶切口。 完全同裂酶：识别序列和酶切位点完全相同（Hind III 和Hsu I） 不完全同裂酶：识别序列相同，但酶切位点不同（Xma I 和Sma I） 同尾酶：有些限制酶虽识别序列不同，但酶切产生的DNA片段具有相同末端（Taq I和Acc I） 杂种位点：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点（一般不能被原来的任何一种同尾酶识别，称为“焊死”） E.coli存在两种DNA甲基化酶：DNA腺嘌呤甲基化酶（Dam）、DNA胞嘧啶甲基化酶（Dcm） 影响限制酶活性的因素： 1．底物DNA分子：DNA的分子结构（空间构象、侧面序列、位点偏爱）、DNA的甲基化程度（采用甲基化酶失活突变的质粒）、DNA的纯度（加大酶量、加大反应体积、延长反应时间、重新重提高纯度DNA） 2．限制酶用量（限制酶通常保存于50%甘油中，贮存于-20℃。） 3．反应缓冲液（MgCl2、NaCl、Tris-HCl、DTT或(-ME、BSA） 4．反应温度和时间：不同限制酶的最适反应温度不同，大多数是37℃ 限制酶的星号活性：限制酶在非标准反应条件下，对识别序列的特异性下降，能切割一些与特异识别顺序类似的序列 星号活性产生的原因： 1．酶与底物DNA比例过高： 100 U/(g. 2．高浓度甘油： 5% v/v 3．低离子强度： 25 mM 4．用其它二价阳离子替代Mg2+：Mn2+、Zn2+、Co2+等 5．高pH值： 8.0 6．含有机溶剂：DMSO、乙醇、乙烯二乙醇等 7．酶切时间过长 抑制星号活性的方法： 1．使用尽量少的酶 2．酶量不应超过反应体积的10%（限制酶贮存于50%的甘油中）. 3．尽量使用推荐的缓冲液 4．使用Mg2+作为反应所需的二价阳离子 5．尽量避免有机溶剂（如制备DNA时引入乙醇）污染 6．使用尽量短的时间完成酶切 导致部分酶切的原因： 1．DNA样品纯度低.2．识别序列甲基化3．酶用量不足4．反应缓冲液不适宜5．反应温度不适宜6．反应时间不够 产生匹配粘端方式：同一限制酶切割、同尾酶切割 产生平端方式：限制酶切割、RNA逆转录合成的cDNA为平端双链、PCR扩增 提高平端连接效率的方法： 1．加大连接酶用量（10倍于粘端连接, 1-2U） 2．加大平端DNA片段的浓度 3．加入10% PEG 8000 4．加入单价阳离子(NaCl)，终浓度150-200 mM E.coli DNA聚合酶 I ： 5’→3’DNA聚合酶活性； 5’→3’核酸外切酶活性； 3’→5’核酸外切酶活性（较低） 用途：缺刻平移法制备同位素标记的DNA探针 Klenow酶： 5’→3’DNA聚合酶活性 3’→5’核酸外切酶活性（较低） 失去5’→3’核酸外切酶活性 用途： 1．补平由限制酶酶切产生的5’突出粘端 2．DNA片段的同位素末端标记. 3．合成cDNA第二链 4．双脱氧末端终止法测定DNA序列 T4 DNA聚合酶： 5’→3’聚合酶活性， 3’→5’核酸外切