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第三章 酶的固定化 第一节 酶的固定化 第二节 辅酶的固定方法 第三节 固定化细胞 第四节 固定化酶的性质及其影响因素 第五节 固定化酶催化反应动力学 对于现代工业来说，酶不是一种理想的催化剂 绝大多数水溶性的酶，酶蛋白对外界环境很敏感，极易失活。催化结束后极难回收，只能进行分批生产。 解决办法?? 第一节 酶的固定化 一、固定化酶（Immobilized Enzyme） 定义：是指在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可回收重复使用。 固定化酶优点： (1)简化了提纯工艺 (2)可以装塔连续反应 (3)有利于工艺自动化和微电脑化 (4)多次使用 (5)较游离酶相比能适应于多酶反应 (6)产品质量高，成本低 固定化酶缺点： ①酶活力有损失 ②工厂初始投资大 ③只能用于可溶性底物，对大分子底物不适宜 ④与完整菌体相比，需要辅助因子的催化反应不适宜于多酶反应 固定化酶的制备原则 ①必须注意维持酶的催化活性及专一性。 ②固定化的载体必须有一定的机械强度 有利于生产自动化，连续化，不能因机械搅拌而破碎或脱落。 ③固定化酶应有最小的空间位阻 尽可能不妨碍酶与底物的接近，以提高产品的产量。 ④酶与载体必须结合牢固 能回收贮藏，反复使用。 ⑤固定化酶应有最大的稳定性 所选载体不与废物、产物或反应液发生化学反应。 固定化酶的制备原则 ⑥固定化酶应容易与产物分离，即能通过简单的过滤或离心就可回收和重复使用。 ⑦固定化酶成本要低，以利于工业使用。 ⑧充分考虑到固定化酶制备过程和应用过程中的安全因素。 固定化载体的选择标准 载体的形式 载体的结构 载体的性质 酶偶联量或装载量和实效系数 二、固定化酶的制备方法 1、物理吸附法(physical adsorption) 是通过氢键、疏水键等作用力将酶吸附于不溶性载体的方法。 选择载体的原则 ①要有巨大的比表面积 ② 要有活泼的表面③ 便于装柱进行连续反应。 常用的载体有： (1)有机载体： 纤维素、骨胶原、火棉胶及面筋、淀粉等。 (2)无机载体： 氧化铅、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、二氧化钛等。 无机载体的吸附容量较低，而且酶容易脱落。 2、离子结合法 (在工业上具广泛的用途) 将酶与含有离子交换基团的水不溶载体相结合而达到固定化的一种方法。 在适宜的pH和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离子交换基团间的相互作用而达到酶固定化的方法。 离子交换剂的吸附容量一般大于物理吸附剂。 ⑴阴离子交换剂： 二乙基氨基乙基(DEAE)—纤维素、混合胺类(ECTEDLA)-纤维素、四乙氨基乙基 (TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、410、900等。 ⑵阳离子交换剂： 羧甲基(CM)—纤维素、纤维素柠檬酸盐、Amberlite CG50、IRC—50、IR—200、 Dowex-50等。 1969年，最早应用于工业生产的固定化氨基酰化酶就是使用多糖类阴离子交换剂DEAE-Sephadex A-25固定化的。 吸附法特点 优点： 操作简单，可供选择的载体类型多，吸附过程可同时达到纯化和固化的目的，所得到的固定化酶使用失活后可以重新活化和再生。酶活性中心不易被破坏和酶高级结构变化少，酶活力损失很少。 缺点： 酶与载体相互作用力弱导致酶易脱落。 吸附程度的影响因素: 1. pH：影响载体和酶的电荷变化,从而影响酶吸附 2. 离子强度：一般认为盐阻止吸附。 3. 蛋白质浓度：若吸附剂的量固定，随蛋白质浓度增加，吸附量也增加，直至饱和。 4. 温度：蛋白质往往是随温度上升而减少吸附。 5. 吸附速度：蛋白质在固体载体上的吸附速度要比小分子慢得多。 6. 载体：非多孔性载体---颗粒越小吸附力越强。多孔性载体--要考虑酶的大小和吸附面积的大小。 3、包埋法 包埋法是将酶物理包埋在高聚物网格内的固定化方法。 如将聚合物的单体和酶溶液混合后，再借助聚合促进剂的作用进行聚合，将酶包埋于聚合物中以达到固定化的目的。 包括凝胶包埋和微囊化包埋两种。 (1)凝胶包埋法： 将酶分子包埋在凝胶高聚物网格内的包埋方法。 聚丙烯酰胺、海藻酸钠、K-角叉菜胶（卡拉胶）、胶原和明胶等 先把丙烯酰胺单体、交联剂（如N,N-甲叉双丙烯酰胺）和悬浮在缓冲溶液中的酶混合，然后加入聚合催化剂（如二甲氨基丙腈与过硫酸钾）使之开始聚合，结果就在酶分子周围形成交联的高聚物网络。 特点: 它的机械强度高，在包埋的同时使酶共价偶联到高聚物上。 缺点：酶容易漏失，以低