实验室试剂配制及实验方法.doc

PBS缓冲液的配制(1(PBS) NaCl 8g KCL 0.2g Na2HPO4 1.44g KH2PO4 0.24g 调pH至7.4，加去离子水至1000ml，放于4℃备用。 Hanks 液 用于冲洗动物组织和细胞，具有等渗和一定的酸性缓冲能力。本实验中使用的是无钙、无镁Hanks 液（又称D- Hanks液），具体配方如下： NaCl 8.00g KCl 0.40g Na2HPO4.12H2O 0.134g NaHCO3 0.35g 1%酚红 2ml 加去离子水至 1000ml 10磅高压灭菌10分钟，0-4℃储存备用。使用前将调pH至7.2-7.4。 胰酶 (0.25%) NaCl 8g KCl 0.4g 柠檬酸钠（5H2O） 1.12g 磷酸二氢钠（2H2O） 0.056g 碳酸氢钠 1g 葡萄糖 1g 胰酶 2.5g 加去离子水至 1000ml 用滤器过滤除菌，分装后放于-20℃备用。 大肠杆菌感受态细胞的制备 按分子克隆实验指南中的氯化钙法制备感受态细胞。以无菌的接种环取冻存的JM83菌种划线接种于LB琼脂平板上，37 ℃温箱培养过夜。次日挑取生长好单个菌落接种于5ml LB 培养液中37 ℃振荡培养过夜。取1ml过夜培养液接种到100ml LB液体培养基中，37 ℃剧烈振荡培养2-3小时使OD600达到0.4左右。在无菌条件下将细菌培养物倒入灭菌后冰预冷的离心管中，冰浴10分钟， 4 ℃ 1600g离心10分钟后尽弃上清。 加入100ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液重新悬浮沉淀的细胞，在冰浴中放置30分钟， 4 ℃1600g离心10分钟后尽弃上清。加入10ml冰预冷的0.1mol/L的CaCl2溶液再次悬浮沉淀的细胞，加入终浓渡为15% 灭菌的甘油，混匀后分装为200 μl/管，直接用于转化或置-70 ℃冰箱保存备用。 CEF细胞制备 取10日龄的SPF鸡胚，先后用碘酒棉和酒精棉消毒气室部位，无菌取出鸡胚，用Hanks液洗涤胚体，去头、四肢和内脏，剪成2mm大小的组织块，用0.25%胰酶溶液(4ml/胚)在37℃水浴中消化12分钟左右，然后倒掉胰酶，用不含血清的Hanks液洗涤2~3次后，再加入适量的营养液（DMEM），吹打分散细胞，用6层纱布过滤，制成每毫升含活细胞数106-107个的细胞悬液，分装为5 ml/60mm平皿，制成CEF单层细胞。 病毒的繁殖及分离纯化 将ILTV王岗株种毒100倍稀释通过鸡胚尿囊膜途径接种120枚10日龄的SPF鸡胚，接毒量为0.2ml/胚，种毒毒价为5.6EID50/0.2ml，将接毒鸡胚置37oC 温箱孵育，24小时以内死亡的鸡胚弃掉。120小时之后，收集有明显痘班的鸡胚尿囊膜(CMV)，用PBS（pH7.4）洗涤之后，将CMV置于组织匀浆器内制成悬液，将CMV悬液置于-20℃冰箱中，反复冻融三次，将该CMV悬液以3000g离心30分钟，弃沉淀，收集上清，将上清以10000g超离心2小时，沉淀用TE(10mmol/L Tris-Cl pH8.0，1mmol/L EDTA)溶解，此即为粗提的病毒。将粗提病毒置于用TE 配制的40%甘油垫上以100000g超速离心2小时，收集沉淀，用TE溶解，此即为纯化的ILTV。 病毒DNA的提取 取0.5ml上述纯化的病毒悬液加入蛋白酶K至终浓度为140μg/ml，加入10%SDS至终浓度为0.4%，37oC水浴消化3~4小时，然后分别用等体积的饱和酚，等体积的饱和酚/氯仿（1:1），等体积的氯仿/异戊醇（24:1）各抽提一次，于水相中加入2倍体积的100%冷乙醇和1/10体积的3mol/L NaAc(pH 4.8)混匀，-20 ℃冰箱过夜，12000g 4℃离心20分钟，弃上清，用70%冷乙醇洗涤沉淀，真空干燥，沉淀用灭菌的TE溶解(10mmol/L Tris-Cl pH8.0，1mmol/L EDTA)，然后置于-20oC冰箱中备用。 转化 首先用乙醇、乙酸铵沉淀回收PCR产物。取PCR产物适