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组织病理学讲义 正确的取材、合适的固定和良好的染色是优质病理工作的基础。 病理工作最基本、最重要的技术是常规组织病理技术。 为适应新技术的开展，要求所需材料： 1．组织细胞的形态完整保存； 2. 最大限度保存组织或细胞成分的抗原性； 3. 抗原不弥散，以保证其准确定位。 一、组织取材 （一）一般原则 1、厚度 0.2～0.3cm；面积 1 ～ 1.5cm2。 2、皮肤、腔道器官及囊壁组织等应剪成 细条，如过长可将其缠绕成同心圆状。 3、骨组织需先经脱钙处理。 4、若需保存新鲜组织，应将所取织用锡箔纸包好，入液氮速冻，然后置-700 C冰箱中。 （二）、取材注意事项 1、刀剪应锋利、避免前后拉动和挤压。 2、避免使用有齿镊，动作轻柔以 免挫伤或挤压组织。 3、应避开坏死组织和血凝块，去掉异物。 4、应取病变主体、病变与正常交界和正常组织各一块。 二、细胞取材及制片 1、印片法：操作简单、细胞抗原保存完好。 2、穿刺法：直接涂片或离心后涂片。 3、沉淀法：先离心后涂片。 4、活细胞标本制备：将细胞直接培养在盖玻片上（细胞爬片），或培养于培养瓶或培养板内，制成细胞悬液，再涂片。 第二节 固定及常用固定剂 一、概念：将组织浸入某些化学试剂，使细胞内的物质能尽量保持其生活状态时的形态结构和位置，这一过程称之为固定。 二、固定的作用 1、保持组织、细胞与生活时相似的结构和形态，防止离体组织自溶和细菌繁殖导致的组织腐败。 2、保持定位细胞内特殊的成分，如细胞内的一些蛋白质经过固定，可沉淀或凝固定位在细胞的原有部位。 3、固定可使组织细胞中各种成分沉淀、凝固并易着色，便于区别不同的组织成分。 4、固定剂兼有组织硬化的作用，能使细胞从半液体状（溶胶）变为固定状（凝胶）有利于切片。 5、有利于保存抗原及DNA、RNA，为免疫组化染色和核酸原位杂交做准备。 三、组织固定的注意事项 1、取材后要及时固定，尤其是温度高的季节，以免腐败。 2、容器：最好选择广口的容器，一是避免组织受挤压变形，二是方便取材时易于取出。 3、固定液要足量，至少应为组织块总体的5倍以上。 4、根据不同研究目的选择不同的固定液。如做Masson染色，最好用甲醛升汞、Zenker液或bouin液固定；保存细胞内糖原应选用Carnoy液固定；显示尿酸盐结晶可用100%酒精固定。 5、固定时间：视组织块大小、固定温度、固定液种类而定。一般固定3小时以上，然后保存于70%酒精中。 温度低于40C时，固定时间应延长（但不能太长） 。大标本除延长固定时间外，还应做多个切面固定，以免固定不均匀。 四、固定方法 1、浸泡法。 2、蒸汽固定法：常用于固定组织中的可溶性物质。 3、注射灌注固定法：用于组织块过大或固定剂难以进入其内部的标本（如整个器官、整只动物）。 4、滴加法：细胞涂片。 5、微波固定法（63～650C）：具有核膜清晰、染色质均匀、组织结构收缩小等优点，但由于其固定时间不易掌握，多不主张运用于小组织块固定。 五、常用固定液及其配制 （一）单纯固定液：由单一化学物质组成。 1、甲醛 （1）优点：价格便宜、组织穿透力强、固定均匀、组织收缩小，可长期保存标本。 （2）缺点：易挥发，有一定毒性。 （2）性质：交联性组织固定剂，主要通过使蛋白质分子发生交联而产生固定作用。它虽不能使白蛋白和核蛋白沉淀，但能与蛋白质中许多氨基酸反应。 （3）适用范围：适合多种特殊染色，对脂类和类脂体、神经及髓鞘均有良好的固定效果；也可固定高尔基体、线粒体和糖类。 （4）使用浓度：10%，即10ml市售原液（40%）加90ml的水，此液的甲醛实际浓度为4%。 2、中性甲醛：以pH7.2～7.4的磷酸缓冲液（PBS）为溶剂配制的甲醛溶液，浓度同前。 优点：固定效果及对组织抗原性的保存均优于一般甲醛溶液，是科研用组织最常用的固定液。 3、酒精 （1）优点：具有硬化、固定、脱水等作用，还能保存糖原和尿酸结晶。 （2）使用浓度：固定组织用80%～95%为好，70%的酒精可用于保存组织。 （3）缺点：组织渗透力较弱；能沉淀白蛋白、球蛋白和核蛋白，核蛋白沉淀后能溶于水，使核染色不良；高浓度酒精固定的组织硬化显著，组织收缩明显且脆，既影响切片，又致组织形态改变，影响诊断；溶解脂肪、类脂质和血红蛋白，还损害其它色素，有时也可影响诊断，故多不使用。 （二）混合固定液 1、A-F液（酒精-甲醛固定液）：固定兼脱水，固定后可直接入95%酒精脱水。 配制方法：95%以上浓度酒精90ml，40%甲醛10ml，混合而成。 2、Bouin液 （1）优点：渗透力强，对组织固定均匀，收缩很小，不会使组织变硬变脆，适用于睾丸活检等小组织