切向流过滤.PPT

* ①Sepharose：由琼脂糖形成束状结构后产生的； ②Sepharose CL：是在Sepharose凝胶基础上加以改进的，CL表示交联。 用2,3-二溴丙醇作为交联剂，在强碱性条件下与Sepharose凝胶反应产生的； ③Superose：是由珠状琼脂糖颗粒经过两次交联后得到的 * 特点： Sepharose凝胶的化学稳定性较好，适用于多数凝胶过滤层析所涉及的实验条件。 pH4~9范围较稳定 温度稳定范围较窄（0~40℃） 机械强度较低，且与琼脂糖含量有关，琼脂糖含量越高，其机械强度相对较高。 分子量分级范围很宽，适合于分离分子量差异较大、对分辨率要求不高的样品。 4b最高流速11.5 6b最高流速14 * 高度偶联的联琼脂糖介质，大大加强了机械性能，流速特快，适合工业规模生产。 ● 经去电荷处理，非特异性吸附极低，提高回收率。 ● 极高的化学稳定性，可用多种促溶剂、有机溶剂工作及1-2M NaOH 在位清洗。 * Sepharose CL有机溶剂纯化！ * Superdex：其中，琼脂糖基质决定了凝胶具有高度的理化稳定性，而葡聚糖链决定了凝胶的层析特性。 Superdex系列凝胶是目前分辨率和选择性最高的凝胶介质之一。颗粒尺寸很小，大小分布均匀，填充成层析柱后柱效非常高（最高可达30000塔板数/米），即使在很高的流速下仍能获得非常高的分辨率 ；在机械性能、化学稳定性及热稳定性等方面均大大优于传统凝胶介质。 * 装柱前：干燥凝胶加水或缓冲液在烧杯浸泡吸水,静置 ，筛选。 柱长选择：细长柱，脱盐：柱高50cm； 分级:100cm。目前市场上的柱子 ,其径高比一般在1: 5～10范围 ,在实际使用时 ,填料量一般是样品量的 30～40倍 ,具体的选择要根据样品的性质和含量进行具体分析。如果所需组分和杂质的分离度较大 ,就可以减少填料量 ,使用内径相对较小的柱子 (如 2 cm × 20 cm的柱子 ) ;如果 Rf相差不到 0.1,就要加大柱子 ,增加填料量 ,比如用 3 cm内径的柱子。 装柱：均匀性:a 蓝色葡聚糖－T2000溶液过柱，观察色带均匀下降。b 对光检查c 用标准样品，测定其层析曲线。 平衡缓冲液应与洗脱缓冲液相同 缓冲液种类、pH、离子强度和添加剂的选择应根据溶液与基质的相互作用、可溶性和样品的生化性质、以及后续操作的要求等选择。 缓冲液最好是水溶性的 pH=6~8 离子强度：0.05~0.5mol/L（常用NaCl） 添加剂：对于疏水性较强的物质，可适当加入一些 表面活性剂（如：5~50mol/L SDS）； 或变性剂（如6mol/L盐酸胍） 使用前通过0.45μm的膜过滤，可防止不溶性小颗粒堵塞柱子。 平衡体积至少为5倍床体积。 上样： (1) 除去不溶物 (2) 样品浓度：浓度大些为好 (3) 上样体积：分析1-2%床体积; 制备20-30% 样品集中上样后，加洗脱液，防止返混 洗脱液：洗脱液成份应与膨胀胶和平衡时所用的液体相同 (2) 操作压：根据所选的凝胶树脂的类型不同而不同。 (1) 多次使用后重新填装。 (2) 短期不用,加0.02%叠氮化钠(NaN3) (3) 长期不用, 酒精浸泡脱水，然后60—80℃烘干。 * 分析型：应选择凝胶颗粒直径较小的介质（如中型、细型及超细型等规格），从而获得较高的柱效及分辨率。 制备型：可选择颗粒较粗、价格相对较低、机械强度较大、能提供较快流速、又易于清洗和重复使用的凝胶介质。 洗脱流速：例如层析柱的结构和材料、柱的尺寸、连接方式、泵的类型及介质的机械强度等。 其中最为关键的因素是介质的强度，流速不能超出该介质的最大流速限制， * IEC具有如下的特点： 料液处理量大，在适宜的操作条件下，分离过程具有浓缩作用； 分辨率较高：优化操作条件可大幅度提高分离的选择性；所需柱长较短可在较高流速下操作； 吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收率高； 离子交换剂种类多，选样余地大，价格也远低于亲和吸附剂。 * IEC具有如下的特点： 料液处理量大，在适宜的操作条件下，分离过程具有浓缩作用； 分辨率较高：优化操作条件可大幅度提高分离的选择性；所需柱长较短可在较高流速下操作； 吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收率高； 离子交换剂种类多，选样余地大，价格也远低于亲和吸附剂。 * IEC具有如下的特点： 料液处理量大，在适宜的操作条件下，分离过程具有浓缩作用； 分辨率较高：优化操作条件可大幅度提高分离的选择性；所需柱长较短可在较高流速下操作； 吸附作用机理明确，非特异性吸附小，产品回收率高； 离子交换剂种类多，选样余地大，价格也远低于亲和吸附剂。 * 疏水性树脂——聚苯乙烯树脂 亲水