[农业]RNA干扰技术及防治水产动物疾病专利技术现状.doc

RNA干扰技术防治水产动物疾病专利技术现状 RNA干扰技术(RNA interference，RNAi)是由内源性或外源性短链RNA诱导同源mRNA 降解，导致基因沉默的现象。从理论上来讲，几乎所有涉及到基因异常高表达的人类、动物、植物疾病都有可能设计出相应的siRNA来沉默疾病相关基因，从而达到治疗目的。由于RNAi在动植物抵抗外源病毒、生长发育调控方面起着重要作用，而且在功能基因组研究、基因治疗方面有着广泛的应用前景，2001、2002 年-RNAi技术连续两次被《Science》杂志评为当年十大科学成就之一，并且Fire A和Mello C两位科学家因在RNA干扰领域的突出贡献获得了2006年度诺贝尔医学/生理学奖。近几年在国际上也掀起了一股研究RNAi的热潮。 一、RNA干扰技术简介 （一）RNA干扰技术的发展历史 1990年，Napoli和van der Krol等共同发现了植物体转基因的共抑制现象。Napoli等将外源色素合成基因导入矮牵牛花中，试图加深花朵的紫颜色，结果多数花瓣颜色并未加深，反而成了花斑的甚至白的，这是因为导入的基因及与其相似的内源基因同时都被抑制所致。【Napoli C,Lemieux C, Jorgensen R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans. Plant Cell, 1990, 2 (4) : 2792289.】 1995年康乃尔大学的Guo和Kemphues利用反义RNA 技术试图阻断秀丽新小杆线虫par－1 基因的表达，同时在对照组实验中给线虫注射正义RNA，以期观察到基因表达增强的结果。但结果却发现正义RNA分子与反义RNA分子均能够阻断par-1基因的表达。他们认为正义RNA分子的这种作用是实验误差而没有进行深入研究。 直到1998年，华盛顿卡耐基研究院的Fire A和马萨诸塞大学癌症中心的Mello C首次将dsRNA———正义链和反义链的混合物注入线虫，结果表现出比单独注射正义链或者反义链都要强得多的基因沉默现象，实际上这正是双链RNA分子在起阻断基因表达的作用。他们将这种现象称为RNAi。【Fire A, Xu S,MontgomeryMK, et al. Potent and specific genetic interference by double2stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Naure, 1998, 391 (6669) : 8062811.]】 （二）RNA干扰技术的原理 RNA干扰的机制迄今还在不断探索之中，目前公认的RNA干扰技术基本原理包括两个步骤。第一步：siRNA的合成。长双链RNA分子在细胞内经一种RNA 酶Ⅲ(RNAaseⅢ 核酸内切酶) Dicer的酶切作用，dsRNA被分割成很多长度约21～23个碱基对的双链siRNA分子。第二步：siRNA 与Dicer 形成RNA引导沉默的复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)，介导RISC对靶mRNA的切割。siRNA 作为引导序列，按照碱基互补原则识别靶基因转录出的mRNA，并引导RICS 结合mRNA。随后siRNA与mRNA 在复合体中换位，核酸酶Dicer 将mRNA 切割成21～23nt 的片段，特异性地抑制靶基因的表达。而新产生的dsRNA 片段可再次形成RISC，继续降解mRNA，从而产生级联放大效应。因此，每个细胞只需要几个siRNA 分子就能够引起强烈的RNAi 效应。此外, siRNA 还可以在RNA 依赖性RNA 聚合酶(RNA dependentRNA polymerase，RdRp) 的作用下进行大量扩增，并转运出细胞，使RNAi 扩散到整个机体并可以传代【NykanesA, Haley B, Zamore PD. ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway. Cell,2001, 107 (3) : 3092321.】oligonucleotide，oligoribonucleotide，gene silence，mRNA target，gene inactivation，gene inhibitor，suppressor gene，marine, aquaculture, aquatic, fishery，crustaceans, A