[农学]CHAPTER6cDNA文库制备及基因鉴定.ppt

2.1 反转录酶催化合成cDNA第一链 2. 当所有组分在0℃混合后，取出2.5μl反应液转移到另一个0.5ml离心管内。在此小规模反应管中加入0.1μl [α-32P] dCTP。 3. 大规模和小规模反应管都在37 ℃温育1h。 4. 温育接近结束时，在小规模反应管中加入1μl 0.25mol/L EDTA，然后移至冰上。大规模反应管则在70℃温育10min，然后移至冰上。 5. 测定小规模反应物中放射性总活度和可被三氯乙酸沉淀的放射性活度。再用合适的DNA分子质量参照物通过碱性琼脂糖凝胶电泳对反应产物进行分析。 2.1 反转录酶催化合成cDNA第一链 6. 按下列方法计算cDNA第一链的合成量 （1）在大规模cDNA反应中，使用10μl含有4中dNTP的溶液，每种dNTP浓度为5 mmol/L（即10μl 20 mmol/L总dNTP），所以大规模反应中必定含有200 nmol dNTP。 （2）因为掺入到DNA中的每种dNTP的分子质量大约是330g/mol，因此反应所能产生的DNA总量为200nmol×330g/mol=66μg DNA。 （3）根据小规模反应结果，计算cDNA合成量 掺入的活度值/总活度值×66=合成量（μg） 2.2 cDNA第二链的合成 合成第一链cDNA时，产生的是mRNA和cDNA第一链的杂合体。用以合成cDNA第二链的引物由RNaseH产生。大肠杆菌聚合酶I以cDNA第一链为模板，从RNA引物3’羟基进行延伸，用新合成的cDNA第二链代替cDNA-mRNA杂合体中残留的mRNA片段。 然后用大肠杆菌连接酶对DNA-DNA杂合体上的缺口进行修补，通过DNA聚合酶将双链cDNA的突出端削成平末端。 最后用T4噬菌体多核苷酸激酶对cDNA末端5’羟基磷酸化，以便于接头或衔接子进行连接。 2.2 cDNA第二链的合成 1. 将下列试剂直接加入合成第一链反应混合物中： 10 mmol/L MgCl2 70μl 2 mol/L Tris-Cl（pH 7.4） 5μl 10 mCi/ml [α-32P] dCTP（400Ci/mmol） 10μl 1 mol/L（NH4)2SO4 1.5μl RNaseH（1000单位/ml） 1μl 大肠杆菌DNA聚合酶I（10000单位/ml） 4.5μl 除去气泡，在16℃温育2-4h。 2. 温育结束后，加入下列试剂： β-NAD（50 mmol/L ） 1μl 大肠杆菌DNA连接酶 1μl 室温温育15min。 2.2 cDNA第二链的合成 3. 温育结束后，加入1μl含有4种dNTP的混合物（每种浓度为10mmol/L）和2μl（5单位）T4噬菌体DNA聚合酶。温育15min。 4. 取出3μl反应物，按步骤7和步骤8计算cDNA第二链合成量。 5. 将5μl 0.5mol/LEDTA（pH 8.0）加入剩余反应物中，用酚氯仿和氯仿分别抽提混合物一次。在0.3mol/L 乙酸钠存在下，通过乙醇沉淀回收DNA，将DNA溶解在90μl TE中。 2.2 cDNA第二链的合成 6. 将下述试剂加到DNA溶液中 10×T4多核苷酸激酶缓冲液 10μl T4多核苷酸激酶 1μl 室温温育15min。 7. 测定步骤4取出的3μl反应物中放射性活度，测定1μl第二链合成反应产物中能被三氯乙酸沉淀的放射性活度。 8. 按下列公式计算cDNA第二链合成量： 第二链反应中所掺入的活度值/总活度值×（66-cDNA第一链的量）=cDNA第二链合成量 2.2 cDNA第二链的合成 9. 用等量酚氯仿对含有磷酸化cDNA（步骤6）的反应物进行抽提。 10. Sephadex G-50用含有10mmol/LNaCl的TE溶液进行平衡，然后通过离子柱层析将未掺入的dNTP和cDNA分开。 11. 加入0.1倍体积的3mol/L乙酸钠和2倍体积的乙醇，沉淀柱层析洗脱下来的cDNA，将样品置于冰上至少15min，然后离心15min，回收沉淀DNA。 2.2 cDNA第二链的合成 12. 用70%乙醇洗涤沉淀物，重复离心。