[农学]PCR技术.ppt

PCR技术的应用 1．普通诊断通过 PCR 技术可以方便快捷地鉴定生物样品中是否含有特定的 DNA 序列，从而广泛用于物种或品系的鉴定，以及临床样本的诊断，病原物的污染鉴别和法医鉴定等。最简单的莫过于设计一对引物或几对引物，加以对照，通过 PCR 扩增来检测样品中的特定 DNA 的存在。 2.反转录 PCR反转录 PCR (Reverse transcriptase-PCR ， RT-PCR)就是以反转录的 cDNA 作模板所进行的 PCR 反应，可用于测定基因表达的强度，还可用于鉴定已转录序列是否发生突变及呈现多态性，克隆 mRNA 的 5 和 3 末端序列，从非常少量的 mRNA 样品构建大容量的 cDNA 文库。在反转录过程中可根据需要选用不同类型的引物，使用基因特异性的引物时， cDNA 第一条链就只有一种，便于对目标基因的表达和多态性进行分析；多聚 T 引物具有将所有的 mRNA 都反转录成 cDNA 的潜力，随机引物可在 mRNA 的绝大多数部位启动转录，产生一群不同起点的 cDNA 。反转录 PCR 可以作为一种独立的操作技术加以应用，也可演变成特殊的 PCR 技术。 PCR技术及实验应用 分子生物学 PCR的用途 体外扩增特异DNA片段的技术，能快速、特异地扩增目的DNA片段。 能通过试管内的数小时反应将特定的DNA 片段扩增数百万倍。 迅速获取大量的单一核酸片段，为分子生 物学研究提供了强大的工具。 1953年，Watson和Crick提出DNA双螺旋结构及半保留复制模型。 1958年，Meselson和Stahl用实验证实DNA半保留复制模型。 70年代以来，人们采用两种思路去尝试建立基因的无性繁殖体系，一是基因克隆技术，二是体外扩增技术。 发展历程 1971年，Khorana（美国MIT教授，1968年诺贝尔医学奖得主）：“经过DNA变性，与合适引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因。” 核酸体外扩增最早设想被遗忘原因: （1）很难进行测序和合成寡核苷酸引物； （2）1970年Smith等发现了II型限制性内切酶，体外克隆基因已成为可能。 1976年，台籍科学家钱嘉韵（Alice Chien）从黄石国家公园的嗜热菌Thermus aquaticus中分离出热稳定的Taq DNA聚合酶。 1985年，美国Cetus公司人类遗传研究室的Mullis发明聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR），Saiki等首次应用PCR法成功地扩增了人?-珠蛋白的DNA，并应用于镰刀状红细胞贫血的产前诊断。 1988年Saiki开始将耐热性Taq DNA聚合酶应用于PCR，整个反应只加一次酶即可，扩增特异性和效率都明显改善，操作大为简化。 1989年被誉为“分子年”，列PCR为十余项发明之首。 1993年，Mullis荣获诺贝尔化学奖。 PCR的基本原理 试管中进行的DNA复制反应，依据 DNA半保留复制的机理； 体外DNA分子于不同温度下可变性和复性的性质； 通过人为控制体外合成系统的温度，使 双链DNA变成单链， 单链DNA与人工合成的引物退火， DNA聚合酶使引物沿着单链模板延伸为双链DNA。 PCR每一步的转换通过温度的改变控制。DNA模板解链（变性）、引物与模板结合（退火）、DNA聚合酶催化新生DNA的合成（延伸）三个步骤构成PCR反应的一个循环。 此循环反复进行，可使目的DNA得以迅速扩增。 理论扩增率：2n递增（n为循环次数），25～30循环，目标DNA可增加109倍。 实际扩增率：(１＋Ｘ)n，X为PCR的实际扩增率，平均约为75%。 由于引物和底物的消耗，酶活力的下降等因素，扩增产物的增加，逐渐由指数形式变为线性形式，所以实际上进行30个循环后，扩增倍数一般可达106～107。 以上“变性、退火、延伸”三部曲为PCR一轮循环。 PCR扩增曲线 PCR 反应体系与流程 反应体系 模板（DNA或RNA） 引物 Taq DNA聚合酶 10×PCR缓冲液 1.5～4 mM Mg2+ 0.2 mM dNTP 反应流程 预变性 变性 退火 延伸 延伸完全 终止 25～35循环 一、PCR 的反应体系 引物（primer） 酶 （Taq DNA polymerase） dNTP 模板 （template） Mg2+ （magnesium） PCR 操作过程 1、预变（Initialdenaturation）． 　　模板DNA完全变性对PCR能否成功至关重要，一般95℃加热3-5分钟。 　　 2、引物退火（Primer annealing） 　　退火温度一般需要凭实验（经验）决定。 　　退火温度对PCR的特异性有较大影响。