[农学]农学类应用微生物学.ppt

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[农学]农学类应用微生物学

第五章 应用微生物的基因操作系统 大肠杆菌系统 酿酒酵母系统 大肠杆菌系统 大肠杆菌系统的特点 载体 质粒载体 噬菌体载体 粘粒(cosmid)载体 受体 感受态(competance)细胞转化 大肠杆菌系统的特点 基因工程是从大肠杆菌系统发展起来的 生长迅速 技术成熟 基因组测序完成 大肠杆菌系统的质粒载体 第一代质粒载体:pBR322 第二代质粒载体: pUC质粒 第三代质粒载体 pBR322 早期应用广泛的克隆载体,4362bp,有Ap和Tc两个抗药性基因 单一切点的限制酶:AvaI, PstI, BamHI, PvuII, ClaI, SalI, EcoRI, HindIII Ap: PstI Tc: BamHI, HindIII, SalI pBR322载体重组子的筛选 Aps Tcs Ap Tc+CycS Apr Tcr ------? Apr Tcr -----------? Apr Tcs Apr Tcs Apr Tcs D-cycloserin: D-Ala(细胞壁组分之一)的结构类似物 pUC质粒 Ap抗性 LacOZ中有多克隆位点(MCS),可在X-gal平板上直接挑选 5溴,4氯,3吲哚-β-半乳糖苷 (无色) β-半乳糖苷酶 (蓝色) 第三代质粒载体 pBR322(复制原点,抗药性) T-噬菌体启动子、Lac启动子 多克隆位点 His尾 穿梭质粒 质粒一般只能在特定的寄主中复制,能穿梭于不同寄主中复制的质粒称为穿梭质粒。 大肠杆菌系统的成熟性,带来了穿梭质粒载体使用上的方便性。 λ 噬菌体类载体 可容纳的较大的外源DNA片段 进入细菌细胞容易 能裂解宿主细胞,提取容易 组建的DNA或cDNA文库易于长期保存 λ噬菌体基因组 双链DNA,48502bp,50基因 EcoRI (12bp)cos A F J att int rec N CI P Q S R cos 头尾合成 重组区 调节区 复制区 裂解区 J-N为非必须区,与噬菌体生长及噬斑形成无关,可被消除或取代,当λ-DNA分子大小为其全长的78%-108%(38~52 kb)时,可以形成感染性噬菌体颗粒。 λ 噬菌体类载体的构建 用突变、缺失等方法,减少限制酶的切割位点,除去必须区内的限制酶位点。 ?EcoR I ?S I ?ligase 在非必须区内进行基因操作,切除一定的DNA片断,有目的的引入一些DNA片断。 插入型载体 λ噬菌体基因组的非必须区内对使用的限制酶有一个酶切位点,DNA重组时外源DNA将在这个位点插入。 EcoR I b538 CI imm434 整个基因组缺失18%,最大插入为 9 kb CI:编码使噬菌体不能复制的阻遏蛋白,噬菌斑混浊,插入后CI失活,噬菌斑透亮 取代型载体 λ噬菌体基因组的非必须区内对使用的限制酶有2个酶切位点,DNA重组时外源DNA将取代这2个位点间的片段。 EcoR I EcoR I SupE 整个基因组缺失27%,可插入 3-18 kb SupE,抑制基因,抑制LacZ基因的amber突变体,在X-gal平板上产生蓝色噬菌斑,取代后噬菌斑无色 λ噬菌体载体与外源DNA重组 粘粒(cosmid)载体 插入外源DNA片断的大小: 质粒:10kb 噬菌体:10-20kb 粘粒:40kb 粘粒(5-10kb): COS+抗药性基因+限制酶单切位点 粘粒 ? 限制酶酶切 ? 连接外源DNA(ligase) ? 体外包装(需要2株带λ溶源突变体的E.coli,冻融后提取包装所需的各种蛋白质)?

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