[农学]实验七+人体外周血淋巴细胞培养.doc

实验五 人的外周血淋巴细胞培养 一、实验原理 外周血液中的小淋巴细胞，几乎都处在G1期(或Go期)，一般情况下是不再分裂的，在培养液中加入植物凝血素 (PAH) 时，这种小淋巴细胞受刺激转化成为淋巴母细胞，随后进入有丝分裂。这样经过短期培养，秋水仙素的处理，低渗和固定，就可获得大量的有丝分裂细胞。本方法已为临床医学、病毒学，药理学、遗传毒理学等方面广泛应用。 二、实验目的 掌握人体微量血液体外培养、制备染色体标本的方法。 三、实验材料 人的外周血。 四、实验器具和药品 1．用具: 2毫升灭菌注射器，离心管，吸管，试管架，量筒，培养瓶，试剂瓶，酒精灯，烧杯，载玻片，切片盒，天平，离心机，恒温培养箱，显微镜。 2．器皿的清洗和消毒 玻璃器皿在使用前，均应用肥皂水洗刷，清水冲净，烘干后浸泡在洗液中至少2h，再用流水冲洗，烘干待消毒。 将已洗净、烘干的玻璃器皿装入铝盒或用纸包装，放入干燥消毒箱内；150℃1h。 隔离衣、口罩。橡皮塞，注射用针筒等则用高温高压消毒(15磅15min)。 3．药品 (1) RPMI“1640”培养基：称取“1640”粉末10.5克，用1000ml的双蒸水溶解，如溶液出现混浊或难以溶解时，可用干冰或CO2气体处理，如pH值降至6.0时，则可溶解而透明。每1000ml溶液加NaHCO，1.0－1.2g，以干冰或CO2气体校正pH至7.0－7.2。立即以5号或6号细菌漏斗过滤灭菌，分装待用。 (2) 肝素：作为抗凝剂使用。称取该粉末160mg(每mg含126U)，用40ml的生理盐水溶解，此溶液的浓度为每ml 500U。高压消毒8磅15min。 (3) 秋水仙素：作为有丝分裂的阻止剂，它能改变细胞质的粘度；抑制细胞分裂时纺锤体形成，使细胞分裂停留在中期。称取秋水仙素4mg，用100ml生理盐水溶解，用6号细菌漏斗过滤，然后放入冰箱4℃保存。使用时用1ml注射器吸取该溶液0。05－0.1ml加入5ml的培养物中，其最终浓度为0.4—0.8ug／ml。 (4) 植物凝血素(PHA)：是淋巴细胞有丝分裂刺激剂。提取PHA的方法有两种。一种比较简单，直接用四季豆的浸出液；另一种较复杂，最后制品为粉末。如用之得当，二种方法均可获得良好的效果。 盐水浸取法：最好用皮色四季豆，但其它颜色如红斑色、黑色.黄色，白色的四季豆亦可。取豆子20g，用水洗净可能粘附在种子外面的化学药物。先在水中浸过夜(4℃)，次日倒去水分，将豆子放入组织搅碎器内，加30ml生理盐水，开动搅碎器使之成为粘糊状，向搅碎器再加70ml生理盐水，混合均匀。置冰箱24h。然后以3000转／min离心15min，取上清液，用生理盐水稀释10倍，5号除菌滤斗过滤，分装小瓶，冰冻保存。 酒精乙醚提取法：四季豆50g，先用生理盐水洗净。将豆浸入60ml盐水中，保存于4℃冰箱内，24h后用组织搅碎器将其磨成匀浆，再加140ml盐水，置4℃冰箱中24h，取出后以6000转／min离心20min，吸取上清液，调pH至5.6(用0.1mol／L HCl调)之后，每100ml上清液加40ml无水酒精，加以搅拌，以3000转／min离心15min，取上清液，弃去沉淀。在每100ml上清液中加170ml10％乙醚无水酒精(10ml乙醚十90ml无水酒精)以3000转／min离心15min，取沉淀放入培养皿中，在含有硅胶的抽气干燥器中抽气2—4d，沉淀物逐渐变得干硬。将沉淀物研磨成粉末，以0.85％NaCl液配成1％的溶液，此PHA溶液经细菌滤器过滤后分装在小瓶中，冰冻保存。使用时每5ml培养物加0.1ml即可。如果在得到沉淀物后的干燥及研磨等过程中充分保持灭菌操作，那么配成的PHA溶液便无需用细菌滤器过滤。 (5)抗菌素 青霉素(以每瓶40万U为例): 以4ML生理盐水(或培养基)稀释，则每ML含10万U。取1ml加入100ml培养基中，则最终浓度为100U／ml。 链霉素(以每瓶50万U为例)：以2ml生理盐水(或培养基)稀释，则每ml含25万U。取0.4ml(含10U)加入1000ml培养基中，则每ml含100U(即100μg)。(100万U=lg，lg=1×106μg)。 (6)姬姆萨染液：0.5g姬姆萨粉末，加33ml纯甘油，在研钵中研细，放在56℃恒温水浴锅中保温90min，再加入33ml甲醇，充分搅拌，用滤纸过滤，收集在棕色细口瓶中保存，作为原液。用时以磷酸缓冲液(pH7.4)1：10稀释。 (7)0.1mol／L磷酸缓冲液： pH7.4—7.6 A. Na2HPO4·12H20 28.8g KH2PO4(无水) 2.67g 溶解于1000ml双蒸水中。 B. Na2HPO4·7H20 2.164g NaH2PO4·2