[农学]第六章植物原生质体培养和体细胞杂交.ppt

第六章　植物原生质体培养和体细胞杂交 陈观水 生命科学学院 jimchen7909@163.com第六章 植物原生质体培养和体细胞杂交 主要内容： 第一节 原生质体的分离和纯化 第二节 原生质体培养 第三节 植物体细胞杂交 学习的目标与要求： 掌握植物细胞原生质体培养的意义，了解原生质分离方法，原生质纯化方法和活力测定方法。掌握原生质体融合概念、介绍原生质体融合方法，了解杂种细胞的筛选、鉴定和杂种植株的鉴定方法。 植物原生质体培养和体细胞杂交 原生质体的概念 植物原生质体(protoplast):指将植物细胞壁去掉后得到的裸露的球形细胞 原生质体的特性 去壁的原生质体容易实现外源遗传物质的导入和吸收。 原生质体具有细胞全能性。 不同来源的原生质体具有彼此融合的能力。 原生质体培养 将植物细胞游离成原生质体，在适宜的培养条件下，使其再生细胞壁，进行经过培养成完成植株 植物原生质体培养和体细胞杂交 植物原生质体培养和体细胞杂交 原生质体的生物学意义 植物原生质体培养和体细胞杂交 体细胞杂交(somatic hybridization) 又称为原生质体融合(protoplast fusion),是指在人工控制条件下，不经过有性过程，两种体细胞原生质体相互融合产生杂种细胞，并使之分化再生,形成新物种或新品种的技术。 植物原生质体培养和体细胞杂交 植物原生质体培养和体细胞杂交 一、原生质体的分离和纯化 1.原生质体的分离 1)材料来源 植物幼嫩的叶片 无菌实生苗的子叶和下胚轴 外植体来源的愈伤组织和悬浮细胞系 花粉细胞 2)材料的预处理 用黑暗处理、低温处理和不同光质照射等方法，可提高某些材料原生质体的产量和活力。 一、原生质体的分离和纯化 1.原生质体的分离 3)酶的种类及酶液配制 原生质体分离常用的商品酶 一、原生质体的分离和纯化 1.原生质体的分离 4)分离方法 一、原生质体的分离和纯化 1.原生质体的分离 4)分离方法 一、原生质体的分离和纯化 1.原生质体的分离 4)分离方法 机械分离法：先将细胞放在高渗糖溶液中预处理，待细胞发生轻微质壁分离，原生质体收缩成球形后，再用机械法磨碎组织，从伤口处可释放出完整的原生质体。 缺点：获得完整的原生质体的数量比较少，能够用此法产生原生质体的植物种类受到限制。 优点：该方法可避免酶制剂对原生质体的破坏作用。 一、原生质体的分离和纯化 1.原生质体的分离 4)分离方法 酶解分离法： 指将材料放入能降解细胞壁的混合等渗酶液中保温一定时间，在酶液的作用下，细胞壁被降解，从而获得大量有活力的原生质体的方法。 常用的酶种类：纤维素酶类（纤维素酶、半纤维素酶、崩溃酶[Driselase]）、果胶酶类（果胶酶和离析酶[Macerozyme]）、蜗牛酶和胼胝质酶。 一、原生质体的分离和纯化 1.原生质体的分离 4)分离方法 酶解分离法 优点：获得量大，适用广泛。 缺点：商品酶制剂均含有核酸酶、蛋白酶、过氧化物酶以及酚类物质会影响所获原生质体的活力 一、原生质体的分离和纯化 1.原生质体的分离 4)分离方法 一、原生质体的分离和纯化 1.原生质体的分离 4)分离方法 一、原生质体的分离和纯化 2.原生质体的纯化 1)过滤-离心法 2)漂浮法 3)界面法 一、原生质体的分离和纯化 2.原生质体的纯化 1)过滤-离心法 利用比重原理，在具有一定渗透压的溶液中，先进行过滤然后低速离心，使纯净完整的原生质体沉积于试管底部。 优缺点： 纯化原生质体比较简单。 由于原生质体沉积于试管底部，造成相互 挤压，常引起原生质体的破碎。 一、原生质体的分离和纯化 2.原生质体的纯化 2)漂浮法 采用比原生质体密度大的高渗溶液（蔗糖、Percoll、Ficoll），使原生质体漂浮在液体表层的纯化方法。 优点：(1)可以避免分离的原生质体因震荡被组织碎片撞击而破损。(2) 所用药品简单，成本低。 缺点及补救措施：对离心力要求比较严格，掌握不好，原生质体则不易漂浮。可采用不同浓度和不同离心速度分次漂浮的方法。 一、原生质体的分离和纯化 2.原生质体的纯化 3) 界面法 又称不连续梯度法，采用两种密度不同的溶液形成不连续梯度，通过离心使原生质体与破损细胞分别处于不同液相中，从而纯化原生质体的方法。