[农林牧渔]第二章基因工程基础1.ppt

第二章基因工程基础（1） 基因工程基础 DNA的体外重组 外源基因表达系统 2.1 DNA的体外重组 DNA体外重组的主要步骤 目的基因的分离 基因工程载体 含目的基因的DNA片段与载体的连接 重组体转入宿主(受体)细胞 重组体克隆的筛选和鉴定 外源基因表达产物的活性测定 外源基因表达产物的分离纯化 2.1.1 基因工程操作中常用的工具酶 限制性内切酶（限制-修饰系统） 连接酶 聚合酶 基因工程修饰酶 2.1.1.1 限制性内切酶 通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶。 从核酸分子的末端开始，逐个降解核苷酸，这种酶叫做核酸外切酶。从核酸分子的内部水解磷酸二酯键使之断裂成小片段，称为核酸内切酶。 限制性内切酶是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列，并在识别序列内或附近特异切割双链DNA的核酸内切酶。 限制-修饰系统 在菌体细胞中有一对酶：限制性核酸内切酶和DNA甲基化酶，它们对DNA底物有相同的识别序列，但有相反的生物功能。 甲基化酶具有种属专一性，只修饰宿主本身的DNA，避免了限制酶对宿主DNA的破坏，对于外源DNA，甲基化酶不能识别，而由限制酶将其水解。 有时，甲基化酶发生差错，误将外源DNA分子修饰，限制酶就不能将其水解，这些外源DNA复制后的产物再次感染同一品系的菌体时就将被认为是自身DNA被加以修饰，从而大量繁殖。 限制-修饰系统的存在保证了物种的遗传稳定，同时也有利于进化的进行。 甲基化酶 大肠杆菌中多含有两种DNA甲基化酶即dam和dcm甲基化酶。dam可在5?-GATC-3?序列中的腺嘌呤N6位置上引入甲基，而dcm则在5?-CCAGG-3?或5?-CCTGG-3?中的胞嘧啶C5位置上引入甲基。 很多较高等的真核生物含有在特定位点CpG和CpNpG的DNA甲基化酶，可使上述序列的胞嘧啶C5位置上甲基化。 在哺乳动物基因组中,甲基化主要发生在CG序列，在植物基因组中甲基化可发生在CG和CNG序列。 甲基化与限制酶选择 在选择限制酶时要注意所选限制酶对甲基化的敏感性，并应根据DNA的不同来源选择不同的限制酶。 对某些位点特异性甲基化作用不敏感的限制酶，适用于对修饰的DNA进行完全消化。 限制性内切酶分类 Ⅰ型限制性内切酶属复合功能酶，兼具限制、修饰两种功能。需要Mg2＋、ATP和S-腺苷蛋氨酸作为辅助因子。具有特定的识别位点，但没有特定的切割位点，一般切割位点距识别位点400 bp以上，并对识别位点进行随机切割，很难形成稳定的特异的切割末端，在基因工程中没有应用价值。 Ⅲ型限制性内切酶也属复合功能酶，有特异的识别位点和切割位点，切割位点距识别位点3?端24～26bp，需要Mg2＋、ATP和S-腺苷蛋氨酸激活，因为已发现的Ⅲ型限制性内切酶种类太少，基因工程中不常用。 Ⅱ型限制酶的特点 有特定的识别序列，长度一般为4～6nt，且呈二重对称； 有特定的酶切位点，能在其识别序列的特定位点处对双链DNA进行切割，产生特定的酶切末端，有三种形式； 其限制-修饰系统由两种酶组成：一是限制酶；二是独立的甲基化酶，它能修饰与限制酶识别位点相重叠的序列。 Ⅱ型限制酶的酶切末端形式 5?突出黏端：如EcoRI： 5?-G?AATTC-3? 5?-G AATTC-3? -CTTAA?G- -CTTAA- G- 3?突出黏端：如PstI： 5?-CTGCA?G-3? 5?-CTGCA G-3? G?ACGTC -G ACGTC- 平端：如SmaI： 5?-CCC?GGG-3? 5?-CCC GGG-3? GGG?CCC -GGG CCC- 限制酶切反应的关键因素 底物DNA的纯度和物理特性 反应系统 反应体积 孵育(保温)时间和温度 底物DNA (1) : 纯度 酶切反应要求最严的成分是底物DNA，酶切产物直接受DNA底物纯度的影响。制备不当的DNA样品不能或只能部分切割。 污染核酸虽不会显著影响酶切反应的效率，但会使反应产物的检测变得困难。例如，应用快速裂解法筛选阳性克隆，跑电泳时，切下的DNA可能会与tRNA