综合提高性实验.ppt

SDS－PAGE测定蛋白质 相对分子质量 【目的要求】 学习SDS测定蛋白质分子量的原理。 掌握垂直板电泳的操作方法。 运用SDS测定蛋白质分子量及染色鉴定。 【实验原理】 电泳 带电颗粒在电场作用下，向着与其电荷相反的电极移动的现象。 PAGE 聚丙烯酰胺凝胶（PAG）是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉双丙烯酰胺(Bis)在加速剂四甲基乙二胺(TEMED)和催化剂过硫酸铵(AP) 的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。以此凝胶作为支持介质的电泳称为PAGE。 PAGE具有电泳和分子筛的双重作用。 SDS是在蛋白质样品中加入SDS和含有巯基乙醇的样品处理液，SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分子间的氢键，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。 将已知分子量的标准蛋白质在SDS中的电泳迁移率对分子量的对数作图，即可得到一条标准曲线。只要测得未知分子量的蛋白质在相同条件下的电泳迁移率，就能根据标准曲线求得其分子量。 浓缩效应 浓缩胶（大孔胶） 浓缩胶缓冲液pH6.7 Tris-HCl, 电极缓冲液pH8.3 Tris-Gly 解离度 ：?Cl ?蛋 ?Gly mcl?clm蛋?蛋mGly?Gly 凝胶中Cl－为快离子， Gly－为慢离子，蛋白质样品被夹在中间。 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 浓缩效应 样品进入浓缩胶有一个堆积浓缩效应(缓冲液pH8.3) 蛋白质从“－”极向“＋”极移动，从浓缩胶进入分离胶，速度变慢，堆积浓缩。 分子筛效应 蛋白质样品进入分离胶（小孔胶）后pH增大(pH 8.9 Tris-HC1)，Gly－解离度增大，不存在快、慢离子之分，蛋白质样品在均一电场强度和pH条件下泳动。 由于各种蛋白质分子量不同，因此质点的 有效迁移率不同，形成不同区带。 分子筛效应 分离胶的孔径小，各分子由于大小和形状不同，所受阻力不同，表现出不同的泳动速度，即分子筛作用。分子量小，形状为球形的泳动速度最快。 【操作方法】 １、安装夹心式垂直板电泳槽 1)装上贮槽和固定螺丝销钉，仰放在桌面上。 2)将长、短玻璃板分别插到凵形硅橡框的凹形槽中，注意勿用手接触灌胶面的玻璃。 3)将已插好玻璃板的凝胶模平放在上贮槽上，短玻璃板应面对上贮槽。 4)将下贮槽的销孔对准已装好螺丝销钉的上贮槽，双手对角线的方式旋紧螺丝帽。 5)竖直电泳槽，在长玻璃板下端与硅胶模框交界的缝隙加入已融化的1%琼脂。其目的是封住空隙，凝固后的琼脂中应避免有气泡。 1）分离胶的制备（按表3-2配制10%的分离胶） 将制备的分离胶溶液，加至长、短玻璃板间的窄缝内，加胶高度距样品模板梳齿下缘约1cm。用1 mL注射器在凝胶表面沿短玻璃板边缘轻轻加一层重蒸水,用于隔绝空气，使胶面平整。约30-60 min凝胶完全聚合.将贮槽的蒸馏水倒去 ，用细条滤纸吸去残留的水液。 将制备的浓缩胶溶液加到长、短玻璃板的窄缝内，距短玻璃上缘0.5cm，然后插入样品槽模板.在上、下贮槽中加入蒸馏水，但不能超过短玻璃板上缘。静置30 min左右，上胶即可聚合，再放置10-20 min，放出蒸馏水，加入电极缓冲液，使液面没过短玻璃板约0.5cm，轻轻取出样品槽模板，即可加样。 3、蛋白质样品的处理 1）标准蛋白质样品的处理 低分子量标准蛋白试剂盒:兔磷酸化酶B MW=97,400  牛血清白蛋白 MW=66,200  牛碳酸酐酶 MW=31,000 胰蛋白酶抑制剂 MW=20,100 鸡蛋清溶菌酶 MW=14,400 开封后溶于200μl样品溶解液中，沸水浴中加热3- 5min后上样。 b)称制备样品1mg，按1mg/mL溶液比例加样品溶解 液，将其转移到带塞的小离心管中，轻轻盖上盖子在沸水浴中加热3min，取出冷却后加样。 将电泳仪的正极与下槽连接，负极与上槽连接，打开电泳仪开关，开