[医药卫生]自体干细胞移植治疗肢体缺血的实验研究.ppt

CD133 免疫细胞化学染色 ×400 VEGFR-2免疫细胞化学染色 ×400 Ⅷ因子免疫细胞化学染色 ×400 Dil-ac-LDL摄取实验 ×400 EPC的不足之处 缺血性疾病患者大都为高龄，且常伴有其他疾病如糖尿病、高胆固醇血症、高血压等，使得其EPC数量更加减少，同时生长因子合成明显不足，使其功能受到明显的影响。 Part 4骨髓动员---增加干细胞数量？ Group 1: +G-CSF Group 2 Control No. of patients (limbs) 35 (43) 103 (111) Mean Age 71.3 69.5 Gender Male Female 23 12 59 35 Ischemic Status of Limbs Claudication Rest Pain Ischemic Ulcer Gangrene 5 (5) 15(19) 9 (12) 6 (7) 12(13) 40(43) 26(28) 25(27) Co-morbidity Diabetes Non-Diabetic Thromboangiitis Obliterans 30 (38) 2 (2) 3(3) 88 (94) 8 (9) 7 (8) MNC Yield G-CSF boosted the yield of MNC 10.8 fold for each ml of BM harvested Vol of BM No. of BM- MNCs P Gp1 196 ±17 ml 5.6 ±2.1 X109 0.001 Gp2 377 ±39 ml 1.0±0.9 X109 Part 5基因转染---改善干细胞功能缺陷？ 从骨髓中提取单个核细胞 加入生长因子使其向EPC方向分化 对培养的EPC进行鉴定，确定其比率 将外源eNOS基因导入EPC中 将转染后的EPC移植进后肢缺血动物模型 观察肢体缺血改善情况 转染分组 A组：Ad5-heNOS重组腺病毒转染组 B组：pEGFP-N1-heNOS重组质粒转染组 C组：未转染组 将外源eNOS基因导入犬EPC中 用pEGFP-N1-heNOS重组质粒转 Ad5-EGFP在MOI为50时，转 染48小时后在488nm激发光显微镜下 染48小时后在488nm激发光显微镜下 观察（×200），发出绿色荧光者为 观察（×100），发出绿色荧光者成 成功转染的犬EPC。 功转染的犬EPC。 转染效率测定 转染效率约为12.5%。 图9. 转染后RT-PCR结果：在转染组中扩增出了约450bp大小的条带，而未转染组结果为阴性。 pEGFP-heNOS重组质粒转染人EPC后的表达与鉴定 图10. 转染后Western blot 结果：转染组所提取蛋白能特异性地结合兔抗人eNOS多克隆抗体，而未转染组结果为阴性。 转染后eNOS蛋白的表达 A组样品： B组样品： C组样品： pg/ml pg/ml pg/ml 1×105个细胞溶解后得到的100μl样品中的eNOS蛋白浓度如下： A、B组P0.01 A、C组P0.01 B、C组P0.05 NO产量测定 –eNOS酶的功能表达 转染48h后细胞上清NO产量测定 A组： B组： C组： μmol/L μmol/L μmol/L A、B组P0.01 A、C组P0.01 B、C组P0.05 转染Ad5-heNOS 的自体EPC治疗犬后肢慢性缺血的实验研究 双侧后肢缺血模型 8周后移植 转染Ad5-heNOS 的自体EPC 移植后4周测定 在研课题 骨髓源干细胞亚群治疗肢体缺血性疾病的比较研究---研究中 …… Welcome to our hospital! * * 自体干细胞移植治疗肢体缺血的实验研究 郭连瑞 首都医科大学宣武医院血管外科 首都医科大学血管外科研究所. Part 1骨髓中是否含有血管内皮祖细胞？ 血管内皮祖细胞的体外培养 犬骨髓源EPC体外定向培养 图a （×200） 图b（×100）