[医药卫生]高效液相色谱分析.ppt

可根据进样体积的需要自已制作定量环，一般不要求精确计算定量环的体积，譬如，一根名义上10 ?L的定量环，实际是9 ?L还是1l ?L并不重要，因为被测样品和校正样品的进样体积保持一致，在计算结果时误差都被抵消了。 进样样品要求无微粒和能阻死针头及进样阀的物质，样品溶液均要用0.45 ?m的滤膜过滤。防止微粒阻塞进样阀和减少对进样阀的磨损。为防止缓冲盐和其它残留物质留在进样系统中，每次结束后应冲洗进样器，通常用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗，再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧。 日常维护 日常维护 紫外检测器 参比池 样品池 光线 硅光电池板 日常维护 故障：样品池受污 表现：样品池和参比池能量相差较大 检查方法：设定250 nm波长，通甲醇或水，查看SMPL EN和 REF EN，如两者相差较大，则样品池受污。 措施：用针筒注入异丙醇，清洗样品池；如污染严重， 拆开样品池，将透镜等放入异丙醇中超声波清洗。 紫外检测器 日常维护 更换氘灯（紫外检测器） 判断氘灯能量： 设定220nm波长，检查参比池能量，如能量低于800，需更换氘灯。 3.4.6 计算机控制系统及数据处理 高效液相色谱数据处理单元： 岛津CLASS－VP色谱工作站 WATERS Millennium 32 4.0工作站 3.5 色谱条件的选择 高效液相色谱法操作条件的选择应遵循色谱理论，主要包括两个方面的问题，即色谱柱效率和溶剂效率。柱效率是指溶质通过色谱柱之后峰的宽度增加了多少，它与溶质在两相中的扩散及传质情况有关，这就是所谓的色谱动力学过程；溶剂效率是与两个物质和固定相、流动相的分子间作用力不同有关，这就是所谓的热力学过程。要提高柱效率，就得改善色谱柱性能和操作条件；要提高溶剂效率，就得提高固定相的选择性。 3.5.1 固定液碳链长短对分离的影响 采用反相键合相C1、C8、C18对以下6种化合物进行分离。可以看出，随着碳链增加，保留时间明显增加，分离度明显提高。(色谱条件：IBM柱200×4.5mm；流动相： Ψ（CH3OH∶H2O）=50∶50；流速：1.0mL/min；检测波长：254nm。) 1-尿嘧啶 2-苯酚 3-乙酰苯 4-硝基苯 5-苯甲酸甲酯 6-甲苯 反相液相色谱固定液碳链长度对分离的影响 3.5.2 对异构体的分离 氯氰菊酯有8种同分异构体，如果采用一根柱子无法将其全部异构体分开。若再与一根手性柱串联使用，就可以分开全部异构体，见图4.2.29。(色谱条件：左图Chirex 3019(Phenomenex)柱，250×4.0mm；右图Chirex 3019柱+Chirex 3020(Phenomenex)柱；流动相：Ψ（己烷∶二氯甲烷∶乙醇）=500∶10∶0.05，流速：1.0mL/min；检测波长：230nm。) 氯氰菊酯8种同分异构体的分离 1-对氨基苯磺酸 2-磺胺甲基嘧啶 3-磺胺异恶唑 4-磺胺嘧啶 pH值对反相色谱法分离的影响 4种磺胺药物在pH 1.25~10范围内的分离。在pH 1.25~3.0时磺胺异恶唑不稳定，没有流出。pH 5.0~7.0流出就发生了。pH 9.0有很好的分离，pH 10.0分离很差。(色谱条件：ODS柱150×4.6mm，5?m；流动相：Ψ（20mM KH2PO4∶CH3CN）=95∶5，流速：1.0mL/min；检测波长：270nm。) 3.5.3 pH值对分离的影响 3.5.4 流速变化 对保留时间的影响 上图：0.4ml/min 中图： 0.8ml/min 下图： 1.2ml/min 3.5.5 流动相比例变化对保留时间的影响 3.5.6 填料细度对分析时间的影响 在相同的流速下，不同的柱长，填料粒径减小，保留时间缩短。压力随粒径变细显著地增高。 (色谱条件：C18填料，色谱柱a，300×4.6mm；色谱柱b，150×4.6mm；色谱柱c，75×4.6mm；流动相：Ψ（CH3OH∶H2O）=60∶40，流速：1.0mL/min) 1-苯酚 2-乙酰苯 3-硝基苯 4-苯甲酸甲酯 5-苯甲醚 6-苯 7-甲苯 色谱柱填料细度对分离时间的影响 3.6 超高效液相色谱法（Ultra Performance Liquid Chromatography，UPLC） 基于小颗粒技术（1.7 ? m） 超高分离度 超高灵敏度 超高速 MS理想的接口 方法转换简单 UPLC（续） 超高压（＞15000psi）系统 仪器系统体积小 要求高速检测器 目前造价昂贵 HPLC与UPLC对同一