cDNA文库_综述.doc

前言 1．cDNA文库（complementary DNA Library）的简介 cDNA 文库指某生物某发育时期所转录的全部 mRNA 经反转录形成的 cDNA 片段与某种载体连接而形成的克隆的集合。经典 cDNA 文库构建的基本原理是用 Oligo(dT) 作逆转录引物，或者用随机引物，给所合成的 cDNA 加上适当的连接接头，连接到适当的载体中获得文库。其基本步骤包括：RNA 的提取(例如异硫氰酸胍法，盐酸胍—有机溶剂法，热酚法等等，提取方法的选择主要根据不同的样品而定)，要构建一个高质量的 cDNA 文库，获得高质量的 mRNA 是至关重要的，所以处理 mRNA 样品时必须仔细小心。由于 RNA 酶存在所有的生物中，并且能抵抗诸如煮沸这样的物理环境，因此建立一个无 RNA 酶的环境对于制备优质 RNA 很重要。在获得高质量的 mRNA 后，用反转录酶 Oligo(dT) 引导下合成 cDNA 第链， cDNA 第链的合成(用 RNA 酶 H 和大肠杆菌 DNA 聚合酶 I，同时包括使用 T4 噬菌体多核苷酸酶和大肠杆菌 DNA 连接酶进行的修复反应)，合成接头的加入、将双链 DNA 克隆到载体中去、分析 cDNA 插入片断，扩增 cDNA 文库、对建立的 cDNA 文库进行鉴定。常规用的是 λ 噬菌体，这是因为 λ DNA 两端具有由12个核苷酸的粘性末端，可用来构建柯斯质粒，这种质粒能容纳大片段的外源 DNADNA文库获得的基因与从cDNA文库获得的是不同的基因组。这是因为DNA文库所含的是带有内含子和外显子的基因组基因，而从cDNA文库中获得的是已经过剪接、去除了内含子的cDNA。通过构建cDNA表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针，更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。因此，eDNA在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方面具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用的基因文库。 3．对cDNA文库质量的评价主要有两个方面 第一方面为文库的代表性，cDNA文库的代表性是指文库中包含的重组cDNA分子反映来源细胞中表达信息(即mRNA种类)的完整性，它是体现文库质量的最重要指标。文库的代表性好坏可用文库的库容量来衡量，它是指构建的原始cDNA文库中所包含的独立的重组子克隆数。库容量取决于来源细胞中表达出的mRNA种类和每种mRNA序列的拷贝数，1个正常细胞含10000～30000种不同的mRNA，按丰度可分为低丰度、中丰度和高丰度三种，其中低丰度mRNA是指某一种在细胞总计数群中所占比例少于0.5％时。满足最低要求的cDNA文库的库容量可以用Clack-Carbor公式N=Ln(1- P)/(1-1/n)计算(P为文库中任何一种mRNA序列信息的概率，通常设为99％；N为文库中以P概率出现细胞中任何一种mRNA序列理论上应具有的最少重组子克隆数；n为细胞中最稀少的mRNA序列的拷贝数；T为细胞中表达出的所有mRNA的总拷贝数)。 第二方面是重组cDNA片段的序列完整性。在细胞中表达出的各种mRNA片段的序列完整性。在细胞中表达出的各种mRNA尽管具体序列不同，但基本上都是由3部分组成，即5端非翻译区，中间的编码区和3端非翻译区。非翻译区的序列特征对基因的表达具有重要的调控作用，编码序列则是合成基因产物—蛋白质模板。因此，要从文库中分离获得目的基因完整的序列和功能信息，要求文库中的重组cDNA片段足够长以便尽可能地反应出天然基因的结构。 摘要：自20世纪70年代中期首例 cDNA 克隆问世以来，构建 cDNA 文库已成为研究功能基因组学的基本手段之一。cDNA 便于克隆和大量表达，它不像基因组含有内含子而难于表达，因此可以从 cDNA 文库中筛选到所需的目的基因，并直接用于该目的基因的表达。通过构建 cDNA 表达文库不仅可保护濒危珍惜生物资源，而且可以提供构建分子标记连锁图谱的所用探针，更重要的是可以用于分离全长基因进而开展基因功能研究。因此，cDNA 在研究具体某类特定细胞中基因组的表达状态及表达基因的功能鉴定方便具有特殊的优势，从而使它在个体发育、细胞分化、细胞周期调控、细胞衰老和死亡调控等生命现象的研究中具有更为广泛的应用价值，是研究工作中最常使用到的基因文库。从1976年 HOFSTETTER 成功的构建了第一个 cDNA 文库以来，构建 cDNA 文库的技术方法经历了一个逐步发展完善的过程。初期 cDNA 文库，由于当时技术的限制，选用质粒载体存在着连接效率低、难以扩增和保存等缺点，而 YOUNG 和 DAVIS 重组载体为表达