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ELISA相关因素实验 1 包被抗原使用浓度的确定 包被抗原的使用浓度过高，既不经济，又可使本底增高;使用浓度过低，则酶标板上有大量位点未吸附抗原，增加了非特异性反应，又影响检测的敏感性。所以必须对包被抗原的使用浓度予以选择。包被抗原使用浓度的确定采用方阵试验法，用系列浓度的包被抗原包被96孔酶标板，将抗血清做倍比稀释，采用间接ELISA法测定包被抗原的最佳使用浓度。间接ELISA法的具体步骤如下: A. 包板:用包被缓冲液(CBS)将包被抗原稀释成系列浓度，100ul/孔，4℃过夜。包被抗原的加法如下表; B. 洗板:PBST洗四次，lmin/次; C. 封闭:5%甘氨酸PBST，200ul/孔，37℃，2h; D. 洗板:PBST洗四次，lmin/次; E. 加一抗:加入系列浓度的抗血清，100ul/孔，37℃，100min。抗血清加样如下表所示; F. 洗板:PBST洗四次，lmin/次; G. 加二抗:1600倍稀释的HRP酶标山羊抗兔IgG(PBST配制)，100ul/孔，37℃，40min; H. 洗板:PBST洗四次，lmin/次; 1. 加底物:200ul TMB储存液+10mL底物缓冲液+7ul H2O2，各5ul/孔，37℃，15min; J. 终止:2M H2S04，50ul/孔; K. 读数:OD450。 包被抗原加样表 包被抗原 稀释倍数 加样孔号 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A 25600X B 12800X C 6400X D 3200X E 1600X F 800X G 400X H 100X 抗血清加样表 加样孔号 抗体稀释倍数 1 PBS 2 PBS 3 51200X 4 25600X 5 12800X 6 6400X 7 3200X 8 1600X 9 800X 10 400X 11 200X 12 100X A B C D E F G H 2 最佳封闭液的选择 封闭是指在包被之后用高浓度的无关蛋白质溶液再包被的过程。抗原或抗体在包被时所使用的浓度较低，抗原或抗体吸附后固相载体表面尚有未被占据的空隙，封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥在ELISA其后的步骤中其他干扰物质的再吸附。试验中选择常用的3%的聚乙二醇(6000)，1%的酪蛋白，5%的甘氨酸，2%的脱脂乳，l%的OVA，5%的OVA，1%的明胶和2%的明胶作为封闭液，采用间接ELISA法测定封闭效果。 具体步骤如下: A. 包板: 用包被缓冲液(CBS)将包被抗原稀释到最佳使用浓度，100ul/孔，4℃过夜; B. 洗板: PBST洗四次，lmin/次; C. 封闭: 分别加入3%的聚乙二醇(6000)，I%的酪蛋白，5%的甘氨酸，2%的脱脂乳，l%的OVA，5%的OVA，l%的明胶和2%的明胶，200ul/孔，37℃，2h; D. 洗板: PBST洗四次，lmin/次; E. 加一抗: 加入1x104~ 512x104倍稀释的抗血清，100ul/孔，37℃，l00min。 F 洗板: PBST洗四次，lmin/次; G. 加二抗: 加入1600倍稀释的H即酶标山羊抗兔xgG(PBsT配制)，100ul/孔，37℃，4omin; H. 洗板: PBST洗四次，lmin/次; 1. 加底物: TMB储存液200ul/孔+10mL底物Buffer+7ul H2O2，50ul/孔，37℃，15min; J. 终止: 加入2M H2SO4，50ul/孔; K. 读数: OD450。 3 HRP酶标抗体使用浓度的确定 抗原和抗体的特异性反应只有在合适的浓度比例时才能产生最高的OD值。在用于具体的ELISA检测时，酶标抗体的最适工作浓受到固相载体的性质，包被抗原或抗体的纯度以及整个检测系统如标本，反应温度和时间等的影响，因此必须在实际测定条件下进行试验，选择能达到高敏感度的最大稀释度作为酶标二抗的适工作浓度。最适的工作浓度就是指酶标二抗稀释至这一浓度时，产生的本底较低，且可获得定的最佳灵敏度，达到最合适的测定条件和测定费用的节省。采用棋盘法进行不同浓度纯化抗清和不同稀释度酶标二抗直接ELISA实验。 步骤如下: A. 将纯化后