[基础医学]重组DNA1技术1.ppt

NUCLEIC ACID STRUCTURE DNA and RNA are large macromolecules with several levels of complexity Nucleotides form the repeating units Phosphodiester bonds link nucleotides to form a strand Two strands interact to form a double helix The double helix interacts withproteins resulting in 3-D structuresin the form of chromatin Nucleotide Components Combining all the parts Nucleotide Polymerization Reaction: Phosphodiester Bond Formation 　 工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶I 逆转录酶 Taq DNA聚合酶 碱性磷酸酶 T4多核苷酸激酶 末端转移酶 S1核酸酶 　 　 限制性核酸内切酶 　　（restriction endonuclease） 　　所有工具酶中最为重要，是一类识别双链DNA分子中某特定的核苷酸序列，并在识别序列内或附近切割DNA双链结构的核酸内切酶，是细菌内存在的保护性酶。　　 命名与分类 根据限制酶的结构和作用特点不同，分为I、II、III三类（p75表）。 Restriction Endonucleases: Type II Restriction Enzymes Restriction Enzymes Restriction Enzyme Mapping DNA ligase 　 　 　 粘性末端连接 Ligation of Restriction Enzyme Digested DNA 碱性磷酸酶 Alkaline phosphatase 催化去除DNA、RNA、dNTP或NTP上的5’端磷酸基团，方便5’端标记同位素，防止连接反应时载体的自身连接。 细菌碱性磷酸酶 Bacterial Alkaline Phosphatase, BAP 牛小肠碱性磷酸酶 Calf Intestinal Alkaline Phosphatase, CIP T4多核苷酸激酶T4 polynucleotide kinase BamH1 GGATCC CCTAGG HaeIII GGCC CCGG Cohesive Ends (5′ Overhang) Cohesive Ends (3′ Overhang) KpnI GGTACC CCATGG Blunt Ends (No Overhang) GATC CTAG DpnI (Requires methylation) Methylation-sensitive Enzymes GGCC CCGG HaeIII (Inhibited by methylation) CCCGGG GGGCCC XmaI (5’ Overhang) CCCGGG GGGCCC SmaI (Blunt Ends) Isoschizomers Enzymes Generating Compatible Cohesive Ends GGATCC CCTAGG BamHI (5’ Overhang) AGATCT TCTAGA BglII (5’ Overhang) CTCGTG GAGCAC BssSI (5’ Overhang) NNCAGTGNN NNGTCACNN TspRI (3’ Overhang) Enzymes Recognizing Non palindromic Sequences 部分常用限制性内切酶 特异识别: 4或6个碱基 回文结构 特异切割 5’突出黏末端 5’-overhang cohesive end 3’突出黏末端 3’-overhang cohesive end 平末端 blunt end 同序同切酶 同序异切酶 同 裂 酶 同 尾 酶 Compatible end 可配伍的末端 制备可控特异片段 5’-CCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGATATCAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGG -3’ 只写出了一条链的序列信息。 找一找 5’-CCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAACTAGTGGATCCCCCGGGCTGCAGGAATTCGA