[基础科学]分子生物学技术.docVIP

实验内容： SDS碱裂解法提取质粒 具体方法： (1) 取菌液1.5 mL至离心管中，12000 rpm离心5 min，弃上清。 (2) 加入100 ul溶液1，充分悬浮菌液； (3) 加入200 ul溶液2，上下颠倒5次，冰上3 min； (4) 加入150 ul溶液3，轻晃10 s，冰上3~5 min； (5) 12000 g离心10min，将上清移至新试管； (6) 加2倍体积异丙醇混匀，室温静置10 min； (7) 12000 g离心5 min，去掉上清； (8) 自然干燥沉淀，加30 ul TE buffer，取3-5 ul 酶切电泳鉴定，剩余-20oC保存。 改进之处： 不使用酚/氯仿，时间变短 注意事项： 无 自己的实验感想： 与采用分子克隆中的方法所得结果没有区别。 感谢参与，已奖励威望2，金钱50，经验50！ 但是有几个问题： (8) 自然干燥沉淀，加30 mL TE buffer，取3-5 mL酶切电泳鉴定，剩余-20oC保存。，单位是否有问题！ sorry，应该是微升，原文已经改了 实验内容：大肠杆菌感受态细胞制备 具体方法： 1.挑一单菌落接种与20mlLB，过夜 2.按1%（v/v）接种于新鲜培养基，210rpm，约2.5h，至OD.600=0.4。冰浴10min 3.分装于1.5ml预冷EP管，室温离心12，000g，20sec。无菌操作，去上清。 4.每管用1ml预冷0.1M CaCl2(含10%甘油)重悬；冰浴5min；室温离心12，000g，20sec。无菌操作，去上清。 5.每管用100ul预冷0.1M CaCl2(含10%甘油)重悬；-70度保存备用。 改进之处： 无须低温离心；适合与没有冷冻离心机的实验室。 注意事项：尽量减少在室温放置的时间有利于提高感受效率。 自己的实验感想： 由于实验室没有大型冷冻离心机，改进后可以不用跑到公共实验室了：）感受态效率不错，不低于常规方法制作的感受态效率 质粒DNA的提取纯化（碱法） 1、取1.5ml 培养液倒入1.5ml eppendorf 管中,4℃下12000g 离心30 秒。 2、弃上清,将管倒置于卫生纸上数分钟,使液体流尽。 3、菌体沉淀重悬浮于100μl 溶液Ⅰ中(需剧烈振荡),室温下放置5-10 分钟。 4、加入新配制的溶液Ⅱ200μl, 盖紧管口，快速温和颠倒eppendorf 管数次,以混匀内容物(千万不要振荡),冰浴5 分钟。 5、加入150μl 预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口，并倒置离心管，温和振荡10 秒,使沉淀混匀,冰浴中5-10 分钟,4℃下12000g 离心5-10 分钟。 6、上清液移入干净eppendorf 管中,加入等体积的酚/氯仿(1:1),振荡混匀,4℃下12000g 离心5 分钟。 7、将水相移入干净eppendorf 管中,加入2 倍体积的无水乙醇,振荡混匀后置于-20℃冰箱中20 分钟，然后4℃下12000g 离心10 分钟。 8、弃上清,将管口敞开倒置于卫生纸上使所有液体流出,加入1ml 70％乙醇洗沉淀一次,4℃下 12000g 离心5-10 分钟。 9、吸除上清液,将管倒置于卫生纸上使液体流尽,真空干燥10 分钟或室温干燥。 10、将沉淀溶于20μl TE 缓冲液(pH8.0，含20μg /ml RNaseA)中，储于-20℃冰箱中。 [注意] 1. 提取过程应尽量保持低温。 2. 提取质粒DNA 过程中除去蛋白很重要,采用酚/氯仿去除蛋白效果较单独用酚或氯仿好,要将蛋白尽量除干净需多次抽提。 3. 沉淀DNA 通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长可使DNA 沉淀完全。沉淀DNA 也可用异丙醇(一般使用等体积),且沉淀完全,速度快,但常把盐沉淀下来,所以多数还是用乙醇。 实验内容：重组子鉴定（菌落PCR） 具体方法： 1.PCR mixture的制备 Taq buffer(10*) 20ul dNTP(2.5mM) 5ul Primer upward(50nM) 10ul Primer downstream(50nM) 10ul ddH2O 147ul Taq(2U/ul) 8ul -------------------------------------------- total 200ul 将上述溶液混匀，10ul每管分装与200ulPCR管中。 2.常温下随机挑选转化板上的转化子，用灭菌的牙签或枪头挑取少量菌体，在LB-Agar平板上轻点，做一copy；然后将沾有菌体的牙签或枪头置于相应的装有PCR mixture的PCR管中洗涤数下（管子做好记号，如平板上点的是1＃，则管子上也标1＃，以便筛选到克隆后的扩到培养），盖紧管子。 3.将混有菌体的PCR mixture置PCR仪按常