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Chapter 5 Modification of Enzyme Molecule第五章 酶分子修饰 生命科学学院 付伟丽 4.1 什么是酶分子修饰？ 通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变，从而改变酶的催化特性的技术过程称为酶分子修饰。即：在体外将酶分子通过人工的方法与一些化学基团（物质），特别是具有生物相容性的物质，进行共价连接，从而改变酶的结构和性质。 酶分子修饰的意义 提高酶的活力 activity 增强酶的稳定性 stability 降低或消除酶的抗原性 immunological property 研究和了解酶分子中主链、侧链、组成单位、金属离子和各种物理因素对酶分子空间构象的影响 structure 酶分子的修饰方法 金属离子置换修饰 大分子结合修饰 侧链基团修饰 肽链有限水解修饰 核苷酸链有限水解修饰 氨基酸置换修饰 核苷酸链置换修饰 酶分子的物理修饰 第一节 酶的金属离子置换修饰 定义： 把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子，使酶的特性和功能发生改变的修饰方法称为金属离子置换修饰。 意义： 通过金属离子置换修饰，可以了解各种金属离子在酶催化过程中的作用，有利于阐明酶的催化作用机制，并有可能提高酶的催化效率，增强酶的稳定性，甚至改变酶的某些动力学性质。 第一节 酶的金属离子置换修饰 含有金属离子的酶举例： α-淀粉酶中的钙离子（Ca2+），谷氨酸脱氢酶中的锌离子(Zn2+)，过氧化氢酶分子中的铁离子(Fe2+)，酰基氨基酸酶分子中的锌离子（Zn2+）,超氧化物歧化酶分子中的铜、锌离子(Cu2+,Zn2+) 得失金属离子的影响： 若从酶分子中除去其所含的金属离子，酶往往会丧失其催化活性。如果重新加入原有的金属离子，酶的催化活性可以恢复或者部分恢复。若用另一种金属离子进行置换，则可使酶呈现出不同的特性。有的可以使酶的活性降低甚至丧失，有的却可以使酶的活力提高或者增加酶的稳定性。 一、金属离子置换修饰的方法 1、酶的分离纯化： 首先将欲进行修饰的酶经过分离纯化，除去杂质，获得具有一定纯度的酶液。 2、除去原有的金属离子： 在经过纯化的酶液中加入一定量的金属螯合剂，如乙二胺四乙酸（EDTA）等，使酶分子中的金属离子与EDTA等形成螯合物。 通过透析、超滤、分子筛层析等方法，将EDTA-金属螯合物从酶液中除去。 此时，酶往往成为无活性状态。 一、金属离子置换修饰的方法 3、加入置换离子： 于去离子的酶液中加入一定量的另一种金属离子，酶蛋白与新加入的金属离子结合，除去多余的置换离子，就可以得到经过金属离子置换后的酶。 注： 金属离子置换修饰只适用于那些在分子结构中本来含有金属离子的酶。 用于金属离子置换修饰的金属离子一般都是二价金属离子，如钙离子、镁离子等。 二、金属离子置换修饰的作用 进过金属离子置换修饰的酶，其特性和催化功能往往发生改变。 通过金属离子置换修饰可以达到下列目的： 1、阐明金属离子对酶催化作用的影响 2、提高酶的催化效率 有些酶通过金属离子置换修饰后可以显著提高酶的催化效率。 3、增强酶的稳定性 有些酶分子中的金属离子被置换以后，其稳定性显著增强。 4、改变酶的动力学特性 第二节 大分子结合修饰macro molecules combine modification 定义： 采用水溶性大分子与酶的侧脸基团共价结合，使酶分子的空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法，称为大分子结合修饰。 是目前应用最广泛的酶分子修饰方法。 第二节 大分子结合修饰 使用一些能与酶非共价地相互作用而又能有效地保护酶的一些添加物，如聚乙二醇、右旋糖苷等，它们既能通过氢键固定在酶分子表面，也能通过氢键有效地与外部水相连，从而保护酶的活力。 一些添加物，如多元醇、多糖、多聚氨基酸、多胺等能通过调节酶的微环境来保护酶的活力。 另一类添加物就是蛋白质。蛋白质分子之间相互作用时，其表面区域内排除了水分子，因而增加了相互作用力，其稳定性也就增加了。 用可溶性大分子，如聚乙二醇、右旋糖苷、肝素等，通过共价键连接于酶分子的表面，形成一层覆盖层。 例如：用聚乙二醇修饰超氧物歧化酶 ，不仅可以降低或消除酶的抗原性，而且提高了抗蛋白酶的能力，延长了酶在体内的半衰期从而提高了酶药效。 每分子核糖核酸酶与6.5分子的右旋糖酐结合，可以使酶活力提高到原有酶活力的2.25倍； 每分子胰凝乳蛋白酶与11分子右旋糖酐结合，酶活力达到原有酶活力的5.1倍 一、大分子结合修饰的方法 1、修饰剂的选择：大分子结合修饰采用的修饰剂是水溶性大分子。例如，聚乙二醇（PEG）、右旋糖酐、蔗糖聚合物（Ficoll）、葡聚糖、环状糊精、肝素、羧甲基纤维素、聚氨基酸等。要根据酶分子的结构和修饰剂的特性选择适宜的水溶性大分子。 2、修饰剂的活化：作为