低温贮藏对板栗多酚氧化酶的影响.doc

低温储藏对锥栗栗子多酚氧化酶活性的影响 许金森 细胞生物学与肿瘤细胞工程教育部重点实验室， 生命科学学院，厦门大学，福建厦门361005中国 摘要 锥栗需要在 -20到4?C贮存 6个月的时间。本文研究了这种贮藏方法对多酚氧化酶（PPO）活性和总酚含量的影响。总酚含量在锥栗栗子呈不均匀分布。板栗多酚氧化酶有最佳温度（40?C），最适pH值（5.0），特异性底物（儿茶酚是最有效的）和相对分子质量（69.0 KDa）。在4?C贮藏时多酚氧化酶的活性从ca. 1180降至to 340Umg?1，在-20?C时则降至ca. 300Umg?1 。在本次研究发现PPO活性和贮藏温度呈显著（P 0.01）相关。此外，贮存在-20?C时胚芽和胚乳的总酚含量比贮存在4?C低。因此，我们发现在这些温度下储存的栗子酚含量和多酚氧化酶活性之间存在统计学显著相关性（P 0.01）。 关键词 锥栗栗子;酚类物质，多酚氧化酶的活性，褐变反应，存储处理 1 引言 锥栗栗子是中国东南部和西南部的知名干水果（郑，1985）。板栗含有丰富的营养成分（蛋白质9.3％，脂质2.7％，糖7.4％，氨基酸酸5.1％，淀粉51.3％），并具有独特的风味和口感。作为补益产品，板栗在中国传统医学中有着悠久的应用历史。（FGAFM，1973年;李，1999）。栗子收获和加工时最大的挑战之一就是控制褐变。在大多数情况下，褐变会降低栗子的风味和外观，并缩短其保质期。这些都会降低作为食品原料的板栗的价格。包括空气干燥，热汤，蒸气蒸（去壳或不去）和偶尔SO2熏蒸在内的一些传统措施，会被用来控制在贮藏和加工中板栗的褐变。然而，这些措施损害板栗的味道、外观，减少其适口性和可接受性。因此，它们限制了栗子在国内外更广泛的销路。 多酚氧化酶（PPO，EC 1. 10. 3. 1）与酶促褐变反应有关（Mayer和Harel，1979年;macheix等，1990）。众所周知，PPO在水果和蔬菜的处理、贮藏和加工过程中能促进多酚物质反应。植物PPO活性不仅受生物因素（如品种，其成熟阶段，其酚种类和数量）的影响，也受采后处理方法的影响(Friedman, 1996; Tom′as-Barber′an and Esp′?n, 2001)。在大多数情况下，植物组织褐变是不受欢迎的，会导致食品质量下降。关于热带水果如荔枝和桂圆，褐变机理的报告揭示了褐变过程的复杂性和周围环境的多样性之间的关系（林等，1988;张等，2000）。其中大部分文章都关注褐变条件和颜色保护的措施。到目前为止，酶促褐变控制方法的研究包括60Co照射，快速冻结，壳聚糖包衣和气调储存（弗里德曼，1996年）。为了扩大栗子在本国范围的市场，中国最近还推出的低温度贮藏。然而直到现在，这种方法对板栗多酚氧化酶活性影响的定量数据还没有着落。目前工作的第一目的是确定在最佳条件下板栗多酚氧化酶部分纯化后的活性。然后，我们测量了冷冻和冷藏对PPO活性的影响。这些结果将有助于我们评估在存储和处理时PPO对栗子的作用。 2 材料和方法 2.1 板栗样品和存储处理 新鲜成熟的锥栗变种：祯栗子（来源于中国福建北部水源镇）。实验室中选用大小直径2-4厘）和健康外观的栗子。5kg鲜板栗被储存在4°C的冰箱，完全覆盖预消毒湿砂（过筛通过直径为2毫米，40％的湿度箱）。另5kg栗子在-20?C被冻结。在六个月的贮藏期内重复取样进行检测。每30天从每个存储温度中随机抽样测定总游离酚的含量和PPO活性。同时在采后24小时内对鲜栗子进行数据测定和分析。 2.2 酚含量的测定 用光度来表示游离酚的含量。不同低温储藏的栗子胚乳和胚芽分开进行抽样，各约10g溶解至均质50ml的10％氯乙酸中，并稀释至100毫升，4?C静置24小时，然后在12000×g离心15分钟。上清用于福林法确定酚含量（洛瑞等，1951）。使用纯儿茶素作为标准，记录在700 nm处的吸光度，取得结果用儿茶素毫克每克干物质（DM）表示。 2.3 板栗多酚氧化酶的分离纯化 板栗多酚氧化酶的分离纯化用由Anosike和Ayaebene（1981）描述的方法并进行了一些修改。不同低温储藏的去壳栗子，在4°C（-20?）冷丙酮匀浆2分钟经过滤得到的残留再次用冷丙酮匀浆。收集经过滤得到的沉淀，在25mM钾磷酸盐缓冲液（pH值7.0）中混合预冷。然后0?C时在14000×g下离心20分钟。得上清（能展现酶的活性）。将上清液加入等量的冷丙酮中，在4?C慢慢搅拌30分钟，然后在16000×g下离心20分钟0?C。沉淀溶解于25mm的钾磷酸盐缓冲液（pH值7.0）。然后，硫酸铵晶体溶解在80％饱和，在4?C保持隔夜随后0?C， 16000×g下离心20分钟。将沉淀分离出并溶解在至少5mL的25mM的钾磷酸盐缓冲（pH值7.