如何选择缓冲液.docx

几乎所有的生化实验都必须用到缓冲液，这是因为我们所处理的材料，生物分子或细胞胞器，在自然的环境中都受到严格恒定的 pH 控制，因此当我们将这些生物巨分子抽提出来后若能将之保存于正常生理 pH 6~8 的条件下，可使这些材料维持最佳稳定性。此外有许多的酵素反应都涉及 H+ 的释放，若无缓冲液维持恒定的酸碱度，许多生化反应将无法顺利进行。虽然大部分的生化实验所需的环境在 pH 6~8 之间，但是仍有少数状况需要极端的 pH 环境，图4-1列出了在生化实验常用的缓冲液及其适用之 pH。以下我们将介绍一些生化实验常用的缓冲溶液。4.1.3 Phosphate buffers磷酸是最常使用的缓冲溶液之一，在 pH 6.5~7.5 之间具有很好的缓冲能力，加上磷酸本身就是细胞及许多生物液的成分之一，因此更能提供一种较“天然”的环境。使用磷酸钠或磷酸钾都具有很高的溶解度，十分容易配制。但磷酸缓冲液有以下缺点：(1) 会与一些有生物活性的离子如钙离子、镁离子产生沈淀 (2) 对高等动物细胞有少许毒性 (3) 会抑制部分生物反应。4.1.4 Tris bufferTris [tris (hydroxymethyl) aminomethane] 可算是生化实验中最常使用的缓冲液，尤其在分子生物实验中最常使用。因为它有极佳的缓冲能力、毒性低、对生物反应的干扰极低，而且纯度很高。Tris 本身是一级胺但是它并不会沈淀钙离子，其 pKa 为 8 因此在 pH 7.5~8.5 有良好的缓冲能力，然而在 pH 7.0 时通常只能配成低浓度 (0.01 M) 此时的缓冲效果就不怎么理想了！Tris 缓冲液具有以下的缺点：(1) 浓度会影响其 pH，通常每稀释 10 倍，pH 会下降 0.1 pH unit (2) 会干扰某些 pH 电极 (3) pH 受温度影响甚大，在摄氏 25~5℃ 间每下降 1℃，pH 下降 0.03 pH unit。因此改进的方式包括了：(1) 稀释后重新校正其 pH 值 (2) 使用特殊不受 Tris 干扰的电极 (3) 在所欲使用的温度下调配所需的缓冲液。4.1.5 Carboxylic Acid Buffers这类缓冲液包括了醋酸盐 (acetate)、甲酸盐 (formate)、柠檬酸盐 (citrate) 以及琥珀酸盐 (succinate) 等等，这类缓冲液提供了 pH 3~6 异于一般缓冲液的缓冲区间，但由于它们都是天然代谢产物，因此有可能会干扰某些生物反应。此外 citrate 与 succinate 也会与一些具生物活性的金属离子 (Fe3+, Zn 2+, Mg2+, etc.) 结合，产生沈淀。其中醋酸与甲酸都具有挥发性，在应用上可直接以真空干燥的方法去除。4.1.6 Borate Buffer and Glycine Bufferborate buffer 的缓冲区间在 pH 8.7~9.7，glycine buffer 则为 pH 9.5~10.1 都属于较碱性的缓冲液。较值得注意的是某些噬菌体 (bacteriophage) 能稳定保存在 borate buffer 中。而 glycine 本身是代谢产物，有可能会干扰部分生物反应，另外，两者都不具有 UV 吸收能力，且不与二价正离子作用。4.1.7 Good’s buffer (Zwitterionic Buffers)在 1960 年代中期 Norman Good 鉴于一般的缓冲液系统并不适合生化实验所使用，因此研究了许多合成的 zwitterionic buffer，找到许多适合生化实验的缓冲液系统，它们都具有以下特质：1. pKa 在 6~8 之间。2. 在水溶液中有高溶解度。3. salt effect 很小。4. 不易被运送通过细胞膜。5. 不易受温度、离子组成、浓度等因素影响解离度。6. 不会与金属离子形成错合物，或错合物不沈淀、不干扰生物活性。7. 化学性质稳定。8. 高纯度。　表4-1列出了常用的 Good’s buffer 及其特性。部分 buffer 如 Tris、HEPES 和 PIPES 在不同的反应条件下可能会有 free radical 产生，因此若对氧化还原敏感的实验要选择不会产生自由基的 MES 或 MOPS。Good’s buffers 实在可称得上是 good buffer 了，但它唯一的缺点就是，贵！表4-1：Goods buffers及其缓冲区间pKa Useful pH(20℃) Buffer range6.15 MES 5.8~ 6.56.62 ADA 6.2~ 7.26.80 PIPES 6.4~ 7.26.88 ACES 6.4~ 7.47.15 BES 6.6~ 7.67.20 MOPS 6.5~ 7.97