实验九 质粒提取与电泳.ppt

三、碱裂解法制备质粒DNA注意点：使用酚－氯仿时注意安全 实验目的 理解碱裂解法制备质粒DNA的原理 掌握提取质粒DNA的方法 掌握DNA琼脂糖凝胶电泳的原理 掌握DNA电泳操作方法及DNA分子量大小的测定  溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0； 溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS； 溶液III，3 M 醋酸钾 / 2 M 醋酸； 溶液Ⅵ：酚：氯仿：异丙醇＝25：24：1  （1）携带质粒的细菌新鲜培养物(已制备好) （2）取1ml 培养物加入1.5ml离心管中，10000rpm离心2 min。 （3）倒掉上清，尽可能倒干净。 （4）细菌沉淀重悬于100ul的溶液Ｉ中，用 移液枪吹打至均匀。须确使细菌沉淀在溶液Ｉ中完全分散。 （5）加200μl新配制的溶液Ⅱ。 盖紧管口，颠倒离心管几次（不要振荡），以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅱ接触。于室温放置２-3分钟至液体清亮。 （6）加150μl的溶液Ⅲ 盖紧管口，颠倒离心管几次（不要振荡），以混合内容物。应确保离心管的整个内表面均与溶液Ⅲ接触。 （7）4℃10000rpm离心10分种，立即将上清（400-450μl）转移到另一离心管中。不要带入沉淀，如有则用枪头挑出或再次离心去除。 （8）加等体积的溶液Ⅵ，振荡、颠倒离心管几次以沉淀DNA，于室温放置２分钟，小心吸取上层水相至另一洁净的离心管中。 （9）加入2倍体积的-80℃冷却的无水乙醇，室温放置２分钟，10000rpm 5min，在管底可见微量的DNA沉淀，小心吸去上清液。 （10）加入1ml70%乙醇，将DNA沉淀悬浮起来后，4℃10000rpm离心５分钟。 （11）小心吸去上清液，将离心管倒置于一张纸巾上以吸尽液体。在37℃温箱中干燥5分钟。 （12）取30μl灭菌水，用枪头吹打沉淀，使其彻底溶解，取9μl的DNA样品进行琼脂糖电泳，其余-20℃保存备用。 实验操作- -质粒DNA电泳 透明胶封固样品槽两头，在一端放置样品梳。 用1×TAE–buffer配制琼脂糖凝胶(0.24g Agaros/32ml 1×TAE–buffer)，在微波炉中加热至琼脂糖溶解。待溶液冷却至60℃，加入适量溴化乙锭至微红，混匀。 将温热的琼脂糖凝胶倒入胶模中，凝胶厚度在5-7mm之间。 凝胶完全凝固后，撕去透明胶，小心地将胶移至装有1×TAE–buffer的电泳槽中，轻轻地拔去梳子，且使缓冲液没过胶面。 　 取9μl的DNA样品与1μl的10*样品缓冲液混合后，用微量取样器慢慢将混合物加至样品孔中。 盖上电泳槽盖并通电，使DNA向阳极移动。 当溴酚蓝在凝胶中移出适当距离（根据DNA的大小、1kb和3kb左右的指示剂来判断）后，切断电源，取出凝胶，在紫外灯下观察，并拍照记录结果，估测质粒分子量的大小。 实验要求 每组同学看到质粒条带 估算出质粒条带的分子量大小 实验报告 实验目的 实验原理 实验步骤 结果与分析 下次实验 病毒的鸡胚接种、血凝和血凝抑制试验 谢 谢！ 实验九 质粒提取与电泳 质粒(plasmid)广泛存在于细菌细胞中, 此外在霉 菌、蓝藻、酵母和某些动植物细胞中也发现有质 粒存在. 质粒是独立于细菌染色体以外的能自我复制的 环状闭合的双股DNA, 质粒DNA一般为细菌染色体 的3%左右,. 作为基因克隆质粒载体的所有质粒DNA分子都必定包括如下三个共同的组成部分: 复制基因、选择标志基因和克隆位点. 一、质粒的一般生物学特性 I: 调节基因 P: 启动子 O: 操纵基因 Z、Y、A: 结构基因: Z编码 β-半乳糖甘酶( β-galactosidase) Y 编码透性酶 ( permease) A 编码乙酰基转移酶( acetylase) Ori:复制子． ＭＣＳ：multiple cloning sites,多克隆位点． A Y Z O P I 大肠杆菌乳糖操纵子简介： 二、宿主的基本要求与性质 ①能够高效吸收外源DNA ②具有使外源DNA进行高效复制的酶系统 ③不具有限制修饰系统 ④不具有DNA重组系统，常用重组缺陷型（RecA-） ⑤便于进行基因操作、筛选和大量繁殖 ⑥具有安全性。宿主细胞应该对人、畜、农作物无害 或无致病性等 四、琼脂糖凝胶电泳技术（Agarose gel electroghoresis）注意点：制、看胶时，戴一次性手套，注意ＥＢ 所用试剂 实验操作- -质粒的提取