实验三、鸡胚细胞的原代培养lz.ppt

注 意 清理台面,用品洗净,交回。 预习下节课内容：细胞的传代培养 一个总的实验报告,包括上周实验准备工作,本周的原代培养和传代培养.。要对结果进行分析。 无菌操作取材 点燃酒精灯，手部消毒。 将蛋置于蛋座（大头朝上），外表消毒。 中镊敲碎蛋壳，沿气室线剥开。 Hank’s－培养皿（A，B）。 小镊剥内膜，挑出鸡胚－ A。 6.左手中镊按住鸡胚，右手小镊剥取鸡胚皮肤－ B。 A换Hank’s，于B中漂洗后转入A，再漂洗一遍，除去血块。 转入10ml的小烧杯，用小剪剪碎组织，0.5~1mm3。 用吸管小心吸取组织碎块，接种于培养瓶生长面（9个点）。 生长面 10.翻转培养瓶，用另外一支吸管吸取1640液3～4ml加于培养瓶。 11.盖塞子，平放拿出超净台。 12.培养瓶侧面标记。清洗用具，交回。 13.干贴壁，37℃，第二天小心翻转培养瓶。培养一周。 24h 培养中的成纤维细胞 2.取材和培养材料的制备 A.切取合适大小的组织块或者器官，在平 衡盐溶液或者培养液中洗涤，除去血污， 剔除脂肪、被膜结缔组织以及坏死的组 织。可滴加培养液或者平衡盐溶液来保 持湿润； B. 将组织块放置于盛有培养液的培养皿中， 剪碎，（接种），组织碎块和培养液一 起移到离心管中，吸去上清液； 1.取材 1）准备工作： A. 解剖取材器具、用品的清洗、包装、 灭菌 B. 工作台面、工作环境的消毒 C. 操作者本人的消毒：肥皂水刷手， 0.2%新洁尔灭浸泡前臂或者用酒精擦 拭消毒，穿工作衣，戴帽、口罩 D.对实验动物消毒 C. 加入蛋白酶消化液，密封于37℃消化 ； D. 消化结束后，加入蛋白酶抑制剂或者含有血清的培养基，终止蛋白酶的活性； E. 用吸管吹打消化液，使单个细胞游离； F. 过滤离心收集单个细胞，以少量的培养液重新悬浮细胞； G. 用计数板计算细胞密度，调节细胞密度，接种。 3.接种与培养 A.植块培养 定义：——将组织切割成一定大小的 植块，接种到培养器皿中，加入 培养液进行培养。 目的：——观察植块的组织学生长行为， ——使植块细胞迁移并在植块外 分裂增殖，取出植块后得 到细胞培养物。 植块培养接种方法 1.用湿润的吸管将植块小心吸取并轻轻吹出到培养瓶中，按照一定的形式或者间隔将植块排列好； 2.加入培养基，倒转培养一天； 3.待植块贴壁后，再倒转培养瓶，使植块浸没在培养液中，继续培养； 4.观察细胞生长情况，按照生长情况更换培养液。 B分散细胞培养 目的——反映了单个细胞的生物学特性 ——对单一细胞类型进行分离和纯化 接种方法： 1. 用吸管吸取一定量的细胞悬液，加入培养器皿中，加入适量的培养液，封口 2. 恒温培养 3. 观察细胞生长状态，及时更换培养液。 C悬浮细胞培养 某些白血病细胞、腹水瘤细胞等。 对培养基不断搅拌或者对培养器皿进行振荡、旋转而维持细胞的悬浮状态。 实验准备工作 洗手 照蛋，选活胚，画出气室。如果表面污物较多，可以用刀片刮除。 戴袖套 超净工作台表面消毒 * 一个组（4人）共用一瓶hanks和一瓶1640。用完盖上。 * 用小镊漂洗，并转入小烧杯。 培养瓶下底面－－ * 一个组（4人）共用一瓶hanks和一瓶1640。用完盖上。 * 用小镊漂洗，并转入小烧杯。 培养瓶下底面－－ * 请背述整个过程 实验三、 鸡胚细胞的原代培养 细胞培养的用途 1.细胞 （实验室、商业化） 2.原代培养、细胞株、细胞系 原代培养：从活体组织分离细胞进行细胞培养；原代培养的细胞生长比较缓慢，而且繁殖一定的代数后（一般10代以内）停止生长。 细胞株：原代培养物经传代培养； ？可能具有相同或不同表型的几种细胞 ？如何分离出某一种细胞 细胞系：细胞具有某一特性 ? 无限、连续传代 （体外转化） 3.缺点： 无组织的三维结构 无细胞和细胞间的相互作用 提 纲 1.培养基的类型及配制 2.原代培养的过程 3.原代培养的注意事项 4. 本次实验操作要点 5.实践操作 培 养 基 培养基（培养液）是维持体外细胞生存和生长的溶液，分天然培养基和合成培养基。 不同的细胞系所需要的培养基是不同的。 （一）天然