微卫星检测方法.doc

微卫星DNA 简单重复序(SSR)也称微卫星DNA，也可称为SSRP(Simple Sequence Repeat Polymorphisms)，STMS (Sequence-tagged microsatellites)。其串联重复的核心序列为1一6 bp，其中最常见是双核昔酸重复，即(CA) n和(TG) n每个微卫星DNA的核心序列结构相同，重复单位数目10一60个，其高度多态性主要来源于串联数目的不同。SSR标记的基本原理：根据微卫星序列两端互补序列设计引物，通过PCR反应扩增微卫星片段，由于核心序列串联重复数目不同，因而能够用PCR的方法扩增出不同长度的PCR产物，将扩增产物进行凝胶电泳，根据分离片段的大小决定基因型并计算等位基因频率。 　　SSR具有以下一些优点：(l)一般检测到的是一个单一的多等位基因位点；(2)微卫星呈共显性遗传，故可鉴别杂合子和纯合子；(3)所需DNA量少。显然，在采用SSR技术分析微卫星DNA多态性时必须知道重复序列两端的DNA序列的信息。如不能直接从DNA数据库查寻则首先必须对其进行测序。 ?1??微卫星DNA的构成及特点????微卫星又称简单序列重复(Simple?Se-quence?Repeats，SSR)。一般以1-6个碱基为核心序列，首尾相连组成的串联重复序列。这种序列存在于几乎所有真核生物的基因组中，含量丰富，且呈随机均匀分布。它们不仅大量分布于基因的间隔区和内含子中，而且还分布于基因的外显子和调控区(如启动子、增强子)，真核生物平均每50-150?kb就存在一个微卫星位点，如在人类基因组中每6?kb就有1个微卫星，禽类基因组中约89?kb出现1个微卫星。微卫星DNA数目巨大，人类基因组中约有5×104-1×105个(CA)n重复序列，重复次数一般为15-60次，重复单位相同，其长度一般小于200?bp，但也有的更长。????每个特定位点的微卫星DNA均由两部分构成：中间的核心区和外围的侧翼区。核心区含有一个以上称为“重复”的短序列，一般该重复单位的碱基对数目不变，而串联在一起的重复单位数目是随机改变的，如果用一种不切重复单位的限制性内切酶把DNA分子切割成限制性片断，该限制性片断中位于核心区的外围即是侧翼区。人群中不同个体可表现为侧翼区相同而串联重复单位的数目不同；也可为有相同数目的重复单位但侧翼区大小不同，或者两者均不同。对那些非微卫星DNA位点的DNA?RFLP研究表明，每个位点的RFLP仅能检测到1个到数个等位基因。因此，可以推论，微卫星DNA位点的侧翼区变异数也仅有少数几个，这样人群中该特定微卫星位点的等位基因差异，主要应来自不同数目的串联重复。????此外，微卫星DNA还具有以下特点： 在正常人群中显多态性现象，即微卫星DNA拷贝数在人群中是可变的； 具有遗传连锁不平衡现象； 均可被转录，有些编码蛋白质，而另一些则不编码蛋白质(位于非转译区的5′和3′端)； 属于不稳定的DNA序列，其数目在某些遗传病中有扩增现象，而这种扩增并非是减数分裂的重组造成，扩增可发生在减数分裂过程中，由一代传递给另一代，也可发生在有丝分裂中，导致嵌合体形成。与成熟人体细胞比较，微卫星DNA在胚胎时期有丝分裂很不稳定； 在不同基因位点上的微卫星DNA的重复顺序可以不同，也可以相同。从理论上说，一种微卫星重复顺序的寡核苷酸探针可确定人类基因内约20个不同位点的微卫星，假设有20种微卫星重复顺序的探针，即可对人类任何基因组位点进行定位，应用前景极大。????2??微卫星的类型及其分布????研究表明(AC)n是真核生物包括人在内的生物基因组中含量最丰富的散在分布重复序列。Weber检测了人类基因组中100多个重复数不同的(AC)n序列，利用一套精细的分类方式将微卫星分为三类： 完全重复序列，指在(AC)n重复中没有其他碱基分散于其中，其比例占总重复序列的64%； 不完全重复序列，指两个或多个不间断的重复(AC)n被连续的非重复碱基序列隔开，这些间隔区不超过三个，含量约为25%； 复合序列，指两类或两类以上的串联重复单位由不多于3个连续的非重复碱基分隔开，但不中断的重复单位的重复数大于5，其比例为11%。不同生物体的基因组中三种序列的比例不尽相同，在猪的基因组中三者的含量分别为71%、19%和10%。???????3??微卫星的功能????微卫星DNA功能尚不完全清楚，目前普遍认为充当基因重组的热点，是基因重排和变异的来源，微卫星DNA通过改变DNA结构或通过与特异性蛋白质结合而发挥其基因调控作用。 ???4??微卫星DNA的检测????4.1??DNA指纹图谱法：根据不同位点的微卫星DNA可有相同重复顺序单位的特点，用一种核心重复顺序作为探针，可检测到许多不同位点的微卫星，经Sou