微生物培养与分离技术目的了解微生物分离的原理掌握常用的分离.DOC

微生物培養與分離技術 目的 了解微生物分離的原理 掌握常用的分離純化微生物的方法 掌握菌落特徵的觀察 學習微生物的接種技術 原理 微生物在固體培養基上生長行成的單個菌落、通常是由一個細胞繁殖而成的集合體。因此可透過挑取單菌落而獲得一種純培養。獲取單個菌落的方法可透過塗碟法、劃碟法等技術完成。 儀器設備 器材：三角錐瓶、玻璃培養皿、玻棒、酒精燈、量筒、定量玻璃吸管、吸球、轉盤、70%酒精、燒杯、稱葯杓、稱葯紙、試管、接種環。 步驟 劃碟法： 進行稀釋，做成稀釋菌液 點燃酒精燈，將接種環燒紅滅菌，等待冷卻沾取菌液。 以平行線的方式，由邊向中心將菌液劃在培養基上。 (接種環應該傾斜45度角，可以避免劃破培養基) 第一區完成後，接種環燒紅滅菌後，不再沾取菌液，劃第二區十應該和第一區的菌液末端交接。劃下一區之前因接種環剛高溫滅菌完，所以先在旁邊空白處降溫再進行(劃的地方不可重疊或往回劃) 第三、四區依此類推即可。 全部完成後，放到37度C恆溫培養箱培養。 塗碟法： 將水樣稀釋，將取來的水樣稀釋，取1ml水樣置量筒，並且加入9ml的培養液做稀釋。 稀釋完後，取0.1ml的菌液分別滴於培養基。將三角彎棒放於95%酒精中，沾取酒精。 三角彎棒取出後，點燃酒精燈，將三角彎棒過火後，檢查酒精是否完全揮發，均勻在培養基上推開，並註名稀釋倍數。 培養基完成，將註記好的培養基放於37度C培養箱中培養。 倒碟法： 取125ml之培養基加入100ml的二段水，充分的搖晃，溶解後，放入高溫高壓滅菌釜中滅菌(放入時蓋子勿鎖緊否則瓶子會爆開) 滅菌後，取出待冷卻後，滴入1ml的菌液加入25ml的培養基混合冷卻凝固後，待全部完成後，放進37度C培養箱中進行培養。 實驗結果 塗碟法 稀釋倍數 10 10 10 10 10 菌落數 原液菌數 平均數 倒碟法 稀釋倍數 10 10 10 10 10 菌落數 原液菌數 平均數 劃碟法 稀釋倍數 10 10 10 10 10 菌落數 原液菌數 平均數 問題討論 你們這一組以三種分離技術(劃碟法、塗碟法和倒碟法)所得之實驗結果是否成功的分離微生物，及在培養基上形成單一菌落 ? 若無單一菌落，說明實驗可能失敗的原因。 劃碟法：有單一菌落。 塗碟法：可能沒有均勻吸取到稀釋菌液，才導致菌落都沒有生成。 倒碟法：有單一菌落。 劃碟法、塗碟法和倒碟法的實驗原理、步驟及其實驗中應注意事項 ? 塗碟法： 原理：滴入稀釋完成後的菌液在培養基中，用三角彎棒均勻塗抹開來後拿去培養，此方法常用於菌體計數。 步驟： 將取來的水樣稀釋，取1ml水樣置入量筒，並且加入9ml的培養液做稀釋。 吸取稀釋完成後的水樣0.1ml滴到培養基中。 三角彎棒用95%酒精消毒過後，均勻的在培養基上推開，並且註名稀釋倍數。 處理完成後，放置37度C恆溫培養箱中培養。 注意事項： 塗碟之前三角彎棒需沾取95%酒精再以酒精燈火燒滅菌，在等冷卻。塗碟時必須均勻推開，均勻塗抹。 劃碟法： 原理：利用接種環將待分離的樣品均勻劃在培養基上，跟其他方法比更需要技巧，如此可將混合生長的菌落順利分離成單一菌落。 步驟： 點燃酒精燈，將接種環燒紅滅菌，待冷卻後沾取菌液進行劃碟。 以平行線由邊至中心，將菌液劃在培養基上，完成第一區(大約1/4)。(接種環應呈45度角，避免劃破培養基)。第一區完成後，接種環燒紅滅菌後，不在沾取菌液，劃第二區時應該和第一區的菌液末端交接。劃下一區之前因接種環剛高溫滅菌完，所以先在旁邊空白處降溫在進行(劃的地方不可重疊或者往回)。 第三、四區依此類推，完成後放到37度C培養箱中培養。 注意事項： 劃的路線不可和以劃過的路線重疊到或者往回劃。 接種環溫度很高，必須先在空白處降溫在進行。 倒碟法又稱混合稀釋法 原理：將樣品滴入空培養皿中後加入被好得玻璃培養皿，搖動混合之後等待凝固，不需要技巧就可得到分離效果。 步驟： 取125ml之培養基加入100ml的二段水，充分搖晃，溶解後，放入高溫高壓滅菌釜中滅菌。(放入時蓋子勿鎖緊否則瓶子會爆開) 滅菌後，取出待冷卻後，滴1ml的菌液加入25ml的培養基混合冷卻凝固後，待全部完成後，放進37度C培養箱中培養。 注意事項： 因倒碟法需先製作培養基，所以在滅菌完後等待降溫時要特別注意，溫度過低培養基會凝固，會導致培養基倒不出來。倒入培養基後需等待確認凝固後再拿到37度C培養箱中培養。 為何實驗需有對照組，其目的為何 ? 若對照組上有微生物生長代表什麼意義 ? 目的用來判斷實驗操作過程中得準確姓，操作時，是否一直保持在無菌狀態。若對照組上出現菌落代表製作培養基的過程或製作倒碟個過程中，這個培養基已經受到污染，這個實驗的可信度也會大幅降低。 心得