基因工程4课件幻灯片.ppt

* B 替换型载体 　 这种载体的中央部分有一个可以被外源DNA片段所取代的DNA片段，可取代部分两侧的多克隆位点是反向重复序列。 * Charon噬菌体载体 Charon噬菌体载体是λ 噬菌体基础上发展出来的一种特殊的噬菌体载体。Charon噬菌体载体带有 β-半乳糖苷酶基因以及相应操纵区和启动子的lac5取代片段。 　　　　插入型载体 　　　 替换型载体 Charon噬菌体载体克隆外源DNA片段的一般程序： 　　①分离线性载体DNA，限制酶切消化 　　②与经相同限制酶消化的外源DNA片段混合连接 　　③包装具有感染能力的噬菌体颗粒 　　④组织化学检测 * 3.3 柯斯质粒载体 柯斯质粒载体，cosmid（cossite-carrying plasmid）是带有粘性末端（cos）的质粒。包括λ 噬菌体的cos序列和质粒复制子的特殊质粒载体。 　　　柯斯质粒载体，能提高质粒载体的外源DNA的容量，因此常用于用于真核基因的克隆。 * pHC79的cos位 点两侧还具有与λ 噬 菌体包装有关的DNA 短序列，而质粒DNA 部分则是一个完整的 复制子，编码着一个 复制起点和两个抗菌 素抗性基因ampr和 tetr。 pHC79兼备了λ 噬菌体载体和 pBR322质粒载体两 方面的优点，其克隆 能力为31~45kb。 * 柯斯质粒载体的特点 （1）具有λ 噬菌体的特性 （2）具有质粒载体的特性 （3）具有高容量的克隆能力 （4）能与同源序列的质粒进行重组整合 * 柯斯克隆 柯斯克隆（cosmid cloning）:应用柯斯质粒载体，在大肠杆菌细胞中克隆大片段的真核基因组DNA技术。 * 3.4 单链噬菌体载体 M13、f1 和 fd 等是一类亲缘关系密切的丝状大肠杆菌噬菌体，都含有长度为6.4kb、彼此具有高度同源性的单链环状DNA分子。 　　单链DNA噬菌体载体有别于其它载体的的优越性是： ① 可以象质粒DNA一样在体外进行纯化和操作。 ② 根据实验方法的不同，可形成噬菌斑或菌落。 ③ 不存在包装限制。 ④ 很容易地测定出外源DNA片段的插入向。 。 ⑤ 能可产生大量纯化的含外源DNA片段插入的单链DNA分子。 * M13 噬菌体概述 M13 噬菌体颗粒的外形呈丝状,大小范围为900nm×9nm，颗粒中包装的只是（+）链的DNA，也称为感染性的单链。 * M13 单链DNA噬菌体的生命周期 * M13 噬菌体在感染的大肠杆菌 细胞中的复制 （a）感染性的单链环状（+）DNA在寄主 酶的作用下转变成双链的RF DNA； （b）RF DNA按θ 形式进行若干复制循环； （c）RF DNA的负链转录成M13的mRNA； （d）M13基因II编码的蛋白质在RF DNA 正链的特定位点切割形成切口； M13基因组的扩增正式开始 （e）利用大肠杆菌DNA聚合酶I，复制叉 沿负链移动，不断合成正链； （f）M13基因II编码的蛋白质切下完整的 子代正链，并进行环化； （g）继续合成子代正链。 M13 噬 菌 体 颗 粒 在 感 染 的 大 肠 杆 菌 细 胞 中 的 复 制 过 程 * M13 载体系列的发展 M13 载体系列命名为mpn，其中n代表整数，如M13mp8、M13mp9等。 M13 载体系列 的系谱图 NMU：亚硝基-N-甲基尿烷 lacHindII片段=lacZOPI：包括 lacI′、lac启动子（P）和 lac操纵子（O）以及lacZ′. lacZ ′:头145个氨基酸密码子 * 3.5噬菌粒载体 虽然M13噬菌体载体可方便地用来制备克隆基因的单链DNA，但也有以下方面的缺点和不足： （1）插入外源DNA片段以后，其遗传稳定性会显著地下降； （2）外源DNA片段总是按一种主要的取向插入； （3）克隆外源DNA的实际能力一般情况下最大仅为1.5kb。 为了解决这个问题，科学工作者已经发展出了一类由质粒载体和单链噬菌体载体结合而成的新型的载体系列，称为 噬菌粒载体（phagemid 或 phasmid）。 * pUC118和pUC119 噬菌粒载体 pUC118和pUC119是一对由pUC18和pUC19质粒与野生型M13噬菌体的基因间隔区（IG）重组而成的噬菌