基因工程介绍各种工具酶课件幻灯片.ppt

考斯质粒与噬菌粒 噬菌粒（phagemid or phasmid） 重要的噬菌粒载体：pBluescript 体外转录载体 pBluescript = pUC + f1-ori + PT3 + PT7 2958 bp MCS lacZ’ PT7 ori Apr f1-ori pBluescript PT3 噬菌体启动子PT3和PT7强化外 源基因的转录 提取出来的单链DNA重组分子 在噬菌体RNA聚合酶的存 在下，又可实现外源基因 的体外转录 人造染色体载体 人类、动物、植物的全基因组序列分析往往需要克隆数百 甚至上千 kb 的DNA片段， 此时考斯质粒和噬菌粒载体的装载 量也远远不能满足需要。 将细菌接合因子或酵母菌染色体上的复制区、分配区、稳 定区与质粒组装在一起，即可构成染色体载体。当大片段的外 源DNA克隆在这些染色体载体上后，便形成重组人造染色体， 它能像天然染色体那样，在受体细胞中稳定的复制并遗传。 目前常用的人造染色体载体包括： 细菌人造染色体（BAC） 酵母人造染色体（YAC） 人造染色体载体 细菌人造染色体（Bacterial Artificial Chromosomes BAC） 细菌人造染色体通常是在大肠杆菌性因子F质粒的基础上 构建的，其装载量范围在50 - 300 kb之间 各种类型的pBACs在大肠杆菌受体菌只能维持单一拷贝 pBACs主要适用于： 克隆大型基因簇（gene cluster）结构 构建动植物基因文库 人造染色体载体 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） YAC载体应含有下列元件： 酵母染色体的端粒序列 酵母人造染色体的构建： pYAC4 CEN4 EcoRI URA3 TEL BamHI TEL ori Apr TRP1 ARS1 酵母染色体的复制子 酵母染色体的中心粒序列 酵母系统的选择标记 大肠杆菌的复制子 大肠杆菌的选择标记 YAC载体的装载量为350 - 400 kb 人造染色体载体 酵母人造染色体（Yeast Artificial Chromosomes YAC） 酵母人造染色体的使用： pYAC4 CEN EcoRI URA TEL BamHI TEL ori Apr TRP ARS EcoRI EcoRI EcoRI BamHI 连接 转化酵母菌 重组酵母染色体 C 用于基因转移的受体菌或细胞 3 基因工程的基本条件 各种基因工程受体的特性 实验室常用的基因工程受体 受体细胞应具备的条件 受体细胞应具备的条件 限制性缺陷型 外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 重组整合缺陷型 用于基因扩增或高效表达的受体细胞（recA-） 具有较高的转化效率 具有与载体选择标记互补的表型 感染寄生缺陷型 防止重组细菌扩散污染，生物武器除外 各种基因工程受体的特性 大肠杆菌 遗传背景清楚，载体受体系统完备，生长迅速，培养简单，重组子稳定 适用于外源DNA的扩增和克隆、原核生物基因的高效表达、基因文库的构建，是DNA重组实验和基因工程的主要受体菌 产结构复杂、种类繁多的内毒素 各种基因工程受体的特性 枯草杆菌 遗传背景清楚，蛋白质分泌机制健全 ，生长迅速，培养简单，不产内毒素 适用于原核生物基因的克隆、表达以及重组蛋白多肽的有效分泌 遗传欠稳定，载体受体系统欠完备 各种基因工程受体的特性 链霉菌 抗生素的主要生产者，分子遗传相对操作简便，不产内毒素 主要用于抗生素生产菌株的改良 遗传不稳定，生长相对缓慢 各种基因工程受体的特性 酵母菌 具有真核生物的特征，遗传背景清楚，生长迅速，培养简单，外源基因表达系统完善，遗传稳定 适用于外源DNA的扩增、克隆以及真核生物基因的高效表达、基因文库的构建、真核生物基因表达调控的研究，是DNA重组实验和基因工程重要的真核性受体菌 内源性蛋白产物种类繁多且含量高 各种基因工程受体的特性 昆虫细胞（家蚕） 具有真核生物的特征，外源基因表达量高，繁殖相对较快，培养成本低廉，遗传稳定 适用于真核生物基因的高效表达 DNA重组操作系统欠完善 各种基因工程受体的特性 哺乳动物细胞（中国仓鼠卵巢细胞 CHO） 与人的亲缘关系近，分子重组表达系统健全，具有合适的糖基化修饰系统 适用于哺乳类动物和人的基因表达调控研究、基因药物的生产，是DNA重组实验和基因工程的主要哺乳动物受体 细胞培养条件苛刻，生