基因工程原理课件幻灯片.ppt

（二）载体特点 1、 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2、?至少应有一个克隆位点，以供外源DNA插入。 3、?至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。 ?注：前三个特点必不可少。 （三）遗传标记基因 1、 标记基因的作用 1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 这种指示可以是选择性的（Ampr ，Tetr ，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ） 2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 * 这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选择性的（如TcS， lacZα），绝大多数为后者。 **有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（lacZ等）。 2、?标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ，Cmlr，Kanr，Strr 2）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ 3、常用的遗传标记基因及其作用机制 1) 四环素抗性基因（ Tetr ，Tcr） Tetracycline 可结合在核糖体30s亚基中的一种蛋白质分子上，抑制核糖体的转位过程。四环素抗性基因编码一种399 AAs蛋白质，与细菌细胞膜结合，阻止四环素分子进入细菌细胞。 2) 氨苄青霉素抗性基因（ Ampr ，Apr） Ampicillin可抑制细菌细胞膜上参与细胞壁合成酶类的活性。Apr抗性基因编码一种分泌到细菌细胞周间质的酶，可特异地切割氨苄青霉素的β—内酰胺环，使氨苄青霉素失活。 3) 氯霉素抗性基因（ Cmlr ，Cmr） Chlorophenicol可结合在核糖体50 S亚基上，阻止蛋白质合成。Cmr基因编码氯霉素乙酰转移酶，使氯霉素乙酰化，导致乙酰化的氯霉素不能结合在核糖体上。 4) 卡那霉素(Kanr), 新霉素(Neor)和G418抗性(G418r)基因 Kanamycin，Neomycin和G418均属脱氧链霉胺氨基葡萄糖苷类抗生素，可结合在核糖体上阻止蛋白质的合成。Kanr等抗性基因均可使这类抗生素磷酸化，使之不能进入细胞内。 5）β—半乳糖苷酶基因（lacZ 和lacZα） β—半乳糖苷酶基因有1021 AAs，基因产物装配为四聚体后才有酶活。该蛋白质可分为两部分：α链和β链。前者负责四聚体装配，后者具β—半乳糖苷酶活性；只有当两者都存在时，才会表现出酶活性，该作用称之为α-互补作用。这两个部分可独立存在， 分别由两个基因编码。为α链编码的基因称之为lacZα(编码145 AAs)。这两个基因（LacZ和LacZα）均可作为标记基因。 lacZ（lacZα）中含有多克隆位点，当无外源DNA片段插入时，质粒表达β—半乳糖苷酶的α-肽，与缺失突变体宿主菌（不能编码α-肽）表达的lacZ基因产物（ β链）互补，产生有活性的β—半乳糖苷酶，在含有指示剂X-gal和诱导剂IPTG的存在下，菌落呈现兰色；外源基因的插入后，破坏了lacZ α-肽基因的结构，细菌内不能产生β—半乳糖苷酶活性，菌落呈白色。 β—半乳糖苷酶基因的优点: a.?酶催化X-Gal水解为兰色产物，检测直观 b. lacZα编码5‘-端可容许很大的变化（如加入多克隆位点）而不影响酶活性 c. lacZα和β链基因的分别表达可使载体小而容量大 P LacZα LacZβ 转录 翻译 α β LacZ基因的结构与产物 pUC18 BamHI片段 重组DNA分子 转化E.coli 外源DNA BamHI片段  涂布在含X-Gal 和Ap的平板上, 白色菌落为重组 子，兰色菌落为 原载体 利用LacZ基因筛选重组子 （四）、质粒载体的类型 1、根据载体的分子生物学特性划分 （1）.?质粒型载体—环状dsDNA分子，自主复制 （2）.?病毒型载体—环状、线状、ss-和ds-DNA分子，形成病毒颗粒 （3）.混合型载体—具质粒和病毒特性，特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性 2、根据载体功能划分 （1）. 普通型