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基因克隆 植物体 植物总RNA（DNA） RT-PCR 合成目的基因 PCR 合成目的基因 凝胶电泳 凝胶回收或 纯化目的基因 A T T A 目的基因插入载体 连接产物的转化 质粒提取 序列测定 基因克隆实验流程 一段已知 序列基因 基因克隆实验流程 聚合酶链式反应技术（PCR） 特异扩增片段的回收纯化 目的片段与载体的连接 质粒DNA的转化 质粒DNA的提取 在高温（93-95℃）下，DNA双链受热变性成为两条单链DNA模板； 在低温（37～65℃）情况下，两条人工合成的寡核苷酸引物与互补的单链DNA模板结合，形成部分双链； 在Taq酶的最适温度（72℃）下，以引物3’端为合成的起点，以单核苷酸(dNTP)为原料，沿模板以5’→3’方向延伸，合成DNA新链。 聚合酶链式反应技术（PCR） 原理 变性 对于富含G、C的模板应适当提高变性温度。 退火 提高退火温度可减少引物与模板之间的非特异结合，提高PCR反应的特异性；降低退火温度则可提高扩增产量。 延伸 延伸时间由扩增片段的长度决定。 循环 次数 PCR的循环次数主要取决于模板DNA的浓度，一般为25~35次。 聚合酶链式反应技术（PCR） 琼脂糖凝胶电泳 利用在盐试剂存在的情况下，核酸能吸附在硅胶上的特性，用于对DNA片段进行纯化。 琼脂糖凝胶回收DNA 1 PCR产物回收DNA 2 特异扩增片段的回收纯化 原理 试剂盒名称：TakaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0 1.在紫外灯下，切出含有目的DNA的凝胶，将发光部位都切下，但是要少切，将胶块放入离心管中。 2.称量：称量（离心管+胶块）质量，计算出胶块的质量。（1mg胶块=1ul胶块） 3.向离心管中加入4倍于胶块体积的DR-I Buffer。（1.5%琼脂糖则加4倍，1%琼脂糖则加3倍） 4.混合后放于75℃水浴中约7min，期间震荡几次，使胶块融化。 5.加入DR-I Buffer 1/2 体积的DR-Ⅱ Buffer，用枪吸打混匀。 6.将柱子放在收集管上，将离心管中溶液倒入柱子中。12000rpm，4℃，离心1分钟。 琼脂糖凝胶回收DNA 过程 7.将收集管中的液体转移到柱子中，重复上一步骤，离心，弃滤液。 8.在柱子中加入500ul Rinse A，12000rpm，4℃，离心1分钟。弃滤液。 9.700ul Rinse B 加入柱子中，12000rpm，4℃，离心30秒，重复一次。 10.将柱子放于新的1.5ml离心管中，在柱子膜的中央处加入15ml Elution Buffer，室温静置1分钟，12000rpm，4℃，离心1分钟。 11.放于-20℃备用。 12.对切胶回收结果进行电泳。 （注：如果片段小于400bp，则在第五步加入终浓度为20%的异丙醇） 琼脂糖凝胶回收DNA 过程 利用PCR产物带有粘性末端A，以及载体上带有T粘性末端，在T4连接酶的作用下，在一定的温度条件下发生连接的原理达到使得目的片断与载体连接的目的。 原理 试剂盒名称：pEASY-T1 Simple Cloning Kit （1）在离心管中加入回收产物3ul，Easy载体1ul，轻轻混合。 （2）25℃放置10分钟（片段不超过1kb，则10分钟，片段在1-2kb，则15分钟）。放在摇床中控温就行。 （3）之后迅速放在冰上。 目的片段与载体的连接 目的片段与载体的连接 转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。 1 2 3 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。 当细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基—钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。 质粒DNA的转化 仪器与试剂 （1）在感受态细胞刚刚解冻时，取50ul感受态细胞加入到连接产物中，轻弹混匀，冰浴20-30分钟。 50 实验过程 （2）将上述混合物转移到预热到42℃的水浴锅中，热休克30秒 (不要摇动)，然后迅速转移到冰浴，冷却1－2分钟。 30 实验过程 （3）加入800ul至室温的LB液体培养基，放入摇床中，200rpm，37℃培养1小时。 实验过程 （4）取适量体积的转化细胞转移到含有适当抗生素的LB固体平板上，用灭过菌的玻璃棒涂布均匀。 实验过程 （5）涂布后放置10-20分钟，让菌体进入到培养基中，之后用封口膜封好，倒置放于摇床中，温度设置为37℃，不要打开转动键，只让摇床控制温度即可。培养12－16个小时。 实验过程 （1）在已经灭菌的小锥形瓶中加入10ml LB液体培养基，再加入10ul Amp，混匀。 （2）在平板中挑取一个单菌落于小锥形瓶中。 （3）放入