革兰氏染色与简单染色幻灯片.pptVIP

实验指导老师：刘芳、吴小平 本课程实验内容 1、显微镜使用、简单染色及革兰氏染色2、培养基的制备与灭菌 3、土壤中自生固氮菌的分离与平板计数4、划线分离及革兰氏染色与荚膜染色 5、固氮菌斜面接种及血球计数板计数 6、菌种保藏及微生物大小测定 实验一、显微镜使用、简单染色与革兰氏染色 一、目的与要求： 1、熟练掌握显微镜特别是油镜的使用技术 2、熟练掌握革兰氏染色法和简单染色法 3、熟练掌握无菌操作技术 4、掌握显微镜使用的基本原理 5、掌握革兰氏染色原理 6、熟练观察菌体的一些简单形态 二、原理 1、显微镜使用原理 分辨率（D)=λ/2NA (光、0.5um,电子、0.05nm) NA=n×sinα/2 (n-介质折射率，空气=1，水=1.33，玻璃=1.52，香柏油=1.515） 物镜参数 聚光器 光源 2、染色原理： 细菌细胞等电点PH一般在2~5，能与中性，碱性及弱酸性的碱性染料结合，因此，通常采用碱性染料进行染色。 革兰氏染色原理 三：方法步骤（一）、革兰氏染色 1、菌株：大肠杆菌；金黄色葡萄球菌 2、流程路线： 涂片 干燥 固定 草酸铵结晶紫染色1min水洗干燥 碘液媒染 1min 水洗干燥 95%乙醇脱色 15~20秒 水洗干燥 番红复染1min 水洗干燥 镜检 (1)涂片 干燥 固定: 2 1 （2）草酸铵结晶紫染色1min 水洗干燥（甩干） （3）碘液媒染1min 水洗 干燥（甩干） 　（4）95%乙醇脱色15~20秒 水洗 干燥（甩干） （5）番红复染　1min 水洗 干燥（吸干） 镜检 三、方法与步骤：（二）简单染色 涂片 干燥 固定 染色 洗涤干燥 镜检 涂片： 染色： 洗涤干燥: 注意事项： （1）涂片不宜过厚。 （2）涂片时滴加无菌水不宜多，否则难以干燥。 （3）固定时，通过火焰速度宜适度，过快达不到固定目的，过慢易使菌体变形，绝不能在火焰上烤，招致原形毁坏。 （4）标本必须干燥，才能置于油镜下观察。 （5）严格掌握脱色程度，是革兰氏染色的关键步骤。如脱色时间太长，阳性菌会误为革兰氏阴性菌，时间不足，革兰氏阴性菌会误为革兰氏阳性菌。 （6）在镜检时，以分散开的菌体的革兰氏染色反应为准。 （7）菌龄 四、作业： 大肠杆菌呈 色，是革兰氏 性菌；金黄色葡萄球菌呈 色，是革兰氏 性菌。 画简单染色视野图 操作示范 革兰氏染色步骤：涂片 干燥 固定 草酸铵结晶紫染色1min 水洗干燥 碘液媒染 1min 水洗干燥 95%乙醇脱色 15~20秒 水洗干燥 番红复染1min 水洗干燥 镜检简单染色步骤： 涂片 干燥 固定 染色 洗涤干燥 镜检 五、值日