普通生物学23重组DNA技术幻灯片.ppt

二十三、重组DNA技术 基因工程的相关技术 基因工程主要的工具酶 基因克隆的质粒载体 重组DNA的基本步骤 基因工程的应用及其成果简介 遗传工程的风险和伦理学问题 （一）基因工程的相关技术 1. 核酸的分子杂交 （1）DNA的变性与复性 变性（熔解）：破坏DNA双链的氢键 复性：DNA恢复双螺旋结构 杂交：不同来源的互补核酸序列的 缔合过程 DNA / DNA RNA / RNA DNA / RNA （2）分子探针寻找特定基因 探针： 纯一、单链 标记方法： 放射性同位素标记 地高辛标记 （3）Southern印迹 检测特定的DNA序列 （4）Northern印迹 检测细胞中活性基因转录的mRNA （5）原位杂交 检测完整细胞中的核酸系列，确定具有不同类型细胞的组织中特定mRNA在单个细胞中表达情况。 原位杂交法筛选DNA重组体图解 复印至硝酸纤维素膜上 用NaOH菌体裂解DNA变性 杂交 放射自显影 32P-cDNA 与放射性cDNA杂交的菌落的斑点 细菌菌落 单链DNA结合到膜上 原位杂交 2. 聚合酶链式反应 （Polymerase chain reaction — PCR） ? 特点： ? 活体外进行 ? 只需很少量DNA作为模板 ? 简便、快速取得大量的DNA片断 （1）PCR技术的基本原理 高温变性→低温退火→适温延伸 PCR技术原理示意图 靶序列 变性和引物复性 循环1 循环2 循环3 变性和引物复性 链延伸 Tag酶 链延伸 （2）Taq DNA聚合酶 耐高温（最适温度为72 0C） （3）寡核苷酸引物 与待扩增的靶DNA区段两端序列互补 人工合成的寡核苷酸短片段（15 ~ 30 bp） （4）PCR技术的应用 DNA分子很稳定（可保存几千 —几万年） 生物进化 古生物学 古人类学 法医学（亲子、嫌疑犯鉴定） DNA测序 制备分子探针 （二）基因工程主要的工具酶 1. 限制性内切核酸酶 是一类在特定的DNA位点切断DNA的酶。又称限制酶或限制性内切酶 现已发现和鉴定出200多种 可分Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型，用途最广的是Ⅱ型酶。 两种切割方式： 粘性末端 平齐末端 2. DNA连接酶及其连接作用 DNA连接酶有两种： （1）大肠杆菌DNA连接酶。只能连接粘性末端。较少用。 （2）噬菌体T4DNA连接酶。可连接粘性末端和平齐末端。 3. 反转录酶 能以DNA或RNA为模板合成DNA链。 （三）基因克隆的质粒载体 克隆载体： 质粒 噬菌体 病毒 1. 质粒（plasmid） 作为高质量克隆载体的质粒必须具有如下特性： （1）具有复制起点 （2）携带易于筛选的选择标记 （3）具有多种限制酶的单一识别位点 （4）具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数 （5）有安全性 2. 质粒载体pBR322 质粒载体pBR322（p — plasmid；B —Bolivar（研究者）；R— Rogigerus （研究者）；322 — 实验编号）的优点： （1）相对分子质量较小 （4361bp） （2）带有一个复制起