有害物质检测课件幻灯片.ppt

(三）酶联免疫法测定 原理： 固相酶联免疫吸附。B1特异性抗体包被于聚苯乙烯微量反应板的孔穴中，再加入样品提取液（未知抗原）及B1抗原（已知抗原），使两者与抗体进行免疫竞争反应，然后加酶底物显色，颜色的深浅取决于抗体和酶标B1抗原结合的量，即样品中B1多，则被抗体结合的B1抗原少，颜色浅，反之则深。用目测法或酶标仪B1标准样比较判断样品中B1的含量。 仪器： 黄曲霉毒素B1测定仪  薄层色谱法测定食品中黄曲霉毒素M1 、B1 其最低检出量0.4 ng是各实验室所公认的。 高效液相色谱法测定食品中AFT B1、B3、Gl、G 2、M1 GB／T 5009．24—1996 黄曲霉毒素的测定 薄层层析法测黄曲霉毒素 薄层层析是在黄曲霉毒素研究方面应用最广的分离技术。自1990年，它被列为AOAC(association of official agricultural chemists)标准方法，该方法同时具有定性和定量分析黄曲霉毒素的功能。 。 原理 本法是利用样品中的黄曲霉毒素B1，经有机溶剂提取、净化、浓缩、薄层分离后，在波长365nm紫外光下产生蓝紫色荧光，根据其在薄层上显示荧光的最低检出量来测定黄曲霉毒素B1的含量。 薄层色谱法黄曲霉毒素B1的最低检出量为0．000 4ug，最低检出浓度为5ug／Kg。 仪器 小型粉碎机 样筛 电动振荡器 玻璃浓缩器 玻璃板5cm×20cm、薄层板涂布器 展开槽(25cm×6cm×4cm) 紫外光灯100一125w、波长365nm滤光片、微量注射器(2) 试剂 三氯甲烷、正己烷(沸程30～60℃)或石油醚(沸程60～90℃)、甲醇、苯、乙腈、无水乙醚或乙醚经无水硫酸钠脱水、丙酮。以上试剂在试验前需先进行空白试验，如不干扰测定即可使用，否则需逐一进行重蒸。 吸附剂－－硅胶 薄层层析用硅胶有多种规格。 应用最多的是掺有粘合剂石膏的硅胶，称有硅胶G，其掺入的石膏量为5-20%不等。硅胶有时含有铁盐及氯离子等杂质，它们可被展开剂提取出来，对层析的结果产生一定影响。 硅胶H――不含粘合剂和其他添加剂（不会被展开剂提出杂质）。 硅胶HF254 ――掺有荧光指示剂，可在短波254纳米的紫外光下观察到荧光。 硅胶GF254――含石膏及荧光物质。 黄曲霉毒素B1标准溶液 1、黄曲霉毒素B1标准贮备液：准确称取1～1．2mg AFTB1标准品，先加入2mL乙腈溶解后，再用苯稀释至100mL，避光、于冰箱4℃保存。此标准液浓度约为10ug／mL。先用紫外分光光度计测定其浓度，再用苯一乙腈混合液调整其浓度为准确10．0ug／mL。在350nm，AFTB在苯一乙腈(98+2)混合液中的摩尔消光系数为19 800 . 2、黄曲霉毒素B标准使用液： I液(1.0ug／mL)：取1mL AFTB标准液(10.0ug／mL)于10mL容量瓶中，用苯一乙腈混合液稀释、定容。 Ⅱ液(0.2ug／mL)：取I液1mL，按上法定容5mL。 Ⅲ液(0.04ug／mL)：取液Ⅱ1mI。，按上法定容5mI。 思考：在配制黄曲霉毒素B标准使用液时，为什么需要用贮备液来稀释而不是直接配制？ 次氯酸钠溶液 配制：取100g漂白粉，加入500mL水，搅拌均匀。另将80g工业用碳酸钠(Na2CO3·H2O)溶于500mL温水中。将两液合并、搅拌、澄清、过滤。此液含次氯酸25g／L。 思考题： 1、次氯酸钠溶液的作用是什么？ 消毒用，污染的玻璃器皿用次氯酸钠溶液浸泡可达到去毒的效果。 2、为什么次氯酸钠溶液能起到消毒的作用？ 操作步骤 样品处理→提取 →浓缩→薄板制备→点样→展开→定量 (1)样品处理  样品从大样经粗碎及连续多次用四分法缩减至0．5～lkg后全部粉碎。粮食样品全部通过20目筛，花生样品全部通过10目筛、混匀。 (2)提取 　　称取20.00g经粉碎样品，置于250mL具塞锥形瓶中，加30mL正己烷或石油醚和100mL甲醇水清液。 　　　振荡30min，静置片刻，以叠成折叠式的快速定性滤纸过滤于分液漏斗中，待下层甲醇水溶液分清后，放出甲醇水溶液于另一具塞锥形瓶内。 　　 　取20.00mL甲醇水溶液置于另一125mL分液漏斗中，加20mL三氯甲烷，振摇2min、静置分层，如出现乳化现象，可滴加甲醇促使分层。放出三氯甲烷层，经盛有约10g预先用三氯甲烷湿润的无水硫酸钠的定量慢速滤纸，过滤于50mL蒸发皿中，再加5mL三氯甲烷于分液漏斗中，重复振摇提取，三氯甲烷层一并滤于蒸发皿中，最后用少量三氯甲烷洗过滤器，洗液并于蒸发皿中。 浓缩 　　　将蒸发皿放在通风柜，于65℃水浴上通风挥干，然后于冰盒上冷却2～3min后，准确加