提高平端连接的效率中国试剂网.PDF

中国试剂网 3.13.12.8 提高平端连接的效率 1、低温下长时间的连接效率比室温下短时间连接的好。 2 、在体系中加一点切载体的酶，只要连接后原来的酶切位点消失。这样可避免 载体自连，应该可以大大提高平端连接的效率。 3、足够多的载体和插入片段是最重要的 。 我认为也不一定，要看片段具体情况而言，有时载体和片段浓度过高，容易产生 线性化产物，不利于环化的。 4 、平端的连接对于离子浓度很敏感 回收的时候多洗洗 我做了几次都很顺的 加 PEG 和扩大酶量 22 度 2 小时后 4C 过夜 5、尽可能缩小连接反应的体积，最好不超过 10 微升，在 5、6 微升左右最佳。 6、建议放在四度冰箱连接两天效率更高比 14 度好 DNA 连接反应 （一）外源ＤＮＡ和质粒载体的连接反应 外源ＤＮＡ片段和线状质粒载体的连接，也就是在双链ＤＮＡ５磷酸和相 邻的 3羟基之间 形成的新的共价链。如质粒载体的两条链都带 5磷酸，可生成 ４个新的磷酸二酯链。但如果质粒ＤＮＡ已去磷酸化，则吸能形成２个新的磷酸 二酯链。在这种情况下产生的两个杂交体分子带有２个单链切口，当杂本导入感 受态细胞后可被修复。相邻的５磷酸和３羟基间磷酸二酯键的形成可在体外由 两种不同的ＤＮＡ连接酶催化，这两种酶就是大肠杆菌ＤＮＡ连接酶和Ｔ４噬菌 体ＤＮＡ连接酶。实际上在有克隆用途中，Ｔ４噬菌体ＤＮＡ连接酶都是首选的 用酶。这是因为在下沉反应条件下，它就能有效地将平端ＤＮＡ片段连接起来。 ＤＮＡ一端与另一端的连接可认为是双分子反应，在标准条件下，其反应速 度完全由互相匹配的ＤＮＡ末端的浓度决定。不论末端位于同一ＤＮＡ分子（分 子内连接）还是位于不同分子（分子间连接），都是如此。现考虑一种简单的情 况，即连接混合物中只含有一种ＤＮＡ，也就是用可产生粘端的单个限制酶切割 制备的磷酸化载体ＤＮＡ。在瓜作用的底物。如果反应中ＤＮＡ浓度低，则配对 中国试剂网 3.13.12.8 的两个末端同一ＤＮＡ分子的机会较大（因为ＤＮＡ分子的一个末端找到同一分 子的另一末端的概率要高于找到不同ＤＮＡ分子的末端的概率）。这倦，在ＤＮ Ａ浓度低时，质粒ＤＮＡ重新环化将卓有成效。如果连接反应中ＤＮＡ浓度有所 增高，则在分子内连接反应发生以前，某一个ＤＮＡ分子的末端碰到另一ＤＮＡ 分子末端的可能性也有所增大。因此在ＤＮＡ浓度高时，连接反的初产物将是质 粒二聚体和更大一些的寡聚体。Dugaiczyk 等(1975; 同时参见 Bethesda Res,Lab. 出版的Focus 第 2 卷，第２、３期合刊）从理论上探讨了ＤＮＡ浓度对连接产物 性质的影响。简而言之，环化的连接产物与多联体连接产物的比取决于两个参数： j 和 i 。j 是ＤＮＡ分子的一个末端在同一分子的另一末端附近的有效浓度，j 的 数值是根据如下一种假设作出的：沉吟液中的ＤＮＡ呈随机卷曲。这样，j 与Ｄ ＮＡ分子的长度成反比（因为ＤＮＡ越长，某一给定分子的两末端的越不可能相 互作用），因此j 对给定长度的ＤＮＡ分子来说是一个常数，与ＤＮＡ深度无关。 j ＝[3/(3 πlb0)]3/2 其中 l 是ＤＮＡ长度，以 cm 计，b 是随机卷曲的ＤＮＡ区段的 长度。b 的值以缓冲液的离子强度为转移，而后者可影响ＤＮＡ的刚度。 i 是溶液中所有互补末端的深度的测量值，对于具有自身互补粘端的双链 dna 而 言，i=2NoMx10-3 末端/ml 这里Ｎo 是阿佛伽德罗常数，Ｍ是ＤＮＡ的摩尔浓度 （单位：mol/L) 。理论上，当j=i 时，给定ＤＮＡ分子的一个末端与同一分子的 另一末端，以及与不同分子的末端相接触的可能性相等。因而在这样的条件下， 在反应的初始阶段中，环状分子与多联体分子的生成速率相等。而当ji 时，有 利于重新环化；当 ij，则有利于产生多联体。图 1.9 显示了ＤＮＡ区段的大小 与连接反应混合物中j:i 之比分别为 0.5、1、2 和 5 时所需ＤＮＡ浓度之间关系（Ｄ ugaiczyk 等，1985）。 现