现代工业发酵调控学课件-储炬发酵调控2复习d(201KB).ppt

代谢流的研究任务 对已知途径而言，是了解生物过程环境变化时对代谢流及其分布的影响，确定流向终产物的比例； 对未知途径而言，是主要途径的鉴别，副产物途径的了解，以便指导遗传操作，克服微生物自身的遗传机制，去除副途径。 代谢工程的要素 代谢工程强调整体的代谢途径而不是个别反应。 代谢工程涉及完整的生物反应网络，途径合成问题，热力学可行性，途径的物流及其控制。 要想提高某一方面的代谢和细胞功能应从整个代谢网络的反应而不是个别反应去考虑。 * * 组成型突变株的获得 组成型突变株可用以下几种方法富集： (1)在诱导物为限制性基质的恒化器中筛选 (2)将菌株轮番在有、无诱导物的培养基中培养 (3)使用诱导性能很差的基质 (4)使用阻碍诱导作用的抑制剂 (5)提高筛选效率的方法 分解代谢物阻遏 大多数受阻遏的酶是可诱导的。实际上有些高效诱导物可逆转分解代谢物的阻遏作用。 某些降解含氮代谢物的酶也会受到容易利用的氮源，如NH4+或谷氨酰胺的阻遏。 分解代谢物阻遏的分子机制 这是指培养基中某种基质的存在会减少(阻遏)细胞中其相应酶的合成速率。 阻遏物(repressor)在分解代谢中是操纵子的调节基因 (R)编码的阻遏蛋白，它能可逆地同操纵基因(O)结合，从而控制其相邻的结构基因 (S)的转录。 分解代谢物阻遏的分子机制 那些能被快速利用的基质，如葡萄糖，其分解代谢物会阻遏另一种异化较难利用基质的酶的合成。 分解代谢物阻遏的分子机制 分解代谢物阻遏，从分子水平看，是分解代谢物抑制腺苷酸环化酶的活性，使环状3,5-腺苷单磷酸(cAMP)不足所致。一般，细胞利用难于异化的的碳源时，胞内的cAMP浓度较高；反之，胞内cAMP浓度较低。 分解代谢物阻遏的分子水平的机制 分解代谢物阻遏 大肠杆菌分解葡萄糖时，其胞内cAMP浓度比利用难于异化的碳源时的胞内cAMP浓度低1,000倍；而用非阻遏性的乙酸盐作碳源时对其浓度的影响很小。 分解代谢物阻遏的分子水平的机制 cAMP与一特殊的蛋白质结合成为cAMP-受体蛋白(CRP)复合物，此复合物与启动基因P的结合，使该基因增强对RNA聚合酶的亲和力，结果增加转录的频率。 cAMP－CRP复合物在P上的结合是RNA聚合酶结合到P上所必需，见图3-19。 分解代谢物阻遏的分子水平的机制 胞内cAMP浓度随腺苷酸环化酶与cAMP磷酸二酯酶的浓度而变化。 缺乏cAMP磷酸二酯酶的突变株对分解代谢阻遏不敏感。 分解代谢物阻遏的分子水平的机制 cAMP在胞内的浓度与ATP的合成速率成反比，胞内cAMP的水平反映了细胞的能量状况，其浓度高，说明细胞处于饥饿状态。 迄今，所有试验过的细菌均含有cAMP。它不是任何已知代谢途径的中间体。 它对细菌的唯一生理作用是调节作用。 耐分解代谢物阻遏的突变株的获得 用强力因素诱变与适当的筛选方法可以获得耐分解代谢物阻遏的突变株。 这类突变株的葡萄糖利用速率减慢，解除了对单一种或一系列酶合成的阻遏作用。 耐分解代谢物阻遏的突变株的获得 其筛选原理是，以一种能引起分解代谢物阻遏的基质作为唯一的氮源，用含有这种氮源的培养基的琼脂平板培养筛选经诱变的菌株。 耐分解代谢物阻遏的突变株的获得 在葡萄糖-脯氨酸琼脂平板上可筛选出耐分解代谢物阻遏的脯氨酸氧化酶的生产菌株(鼠伤寒杆菌突变株)。 因脯氨酸氧化酶的合成受葡萄糖的阻遏，野生型亲株不能生长在这样的培养基上，只有耐分解代谢物阻遏的突变株才能从氧化脯氨酸中取得生长所需的氮源。 耐分解代谢物阻遏的突变株的获得 一般，组氨酸降解酶类受葡萄糖的阻遏，而从组氨酸的分解代谢中获得氮源又是菌的生长所必需。 将产气气杆菌连续移植到一含有葡萄糖及组氨酸为唯一的氮源的培养基上，用于筛选耐分解代谢物阻遏的突变株。 故能在这种培养基上生长的必然是能耐葡萄糖阻遏的突变株。 耐分解代谢物阻遏的突变株的获得 另一种方法是轮番让菌株在含有葡萄糖和不含葡萄糖的培养基上生长。 亲株从含有葡萄糖的培养基移种到含有乳糖、麦芽糖、乙酸或琥珀酸的培养基上，其生长会出现一延迟期。 耐分解代谢物阻遏的突变株的获得 其它通常受氨阻遏的酶有：亚硝酸还原酶、硝酸还原酶、固氮酶、乙酰胺酶、脲酶、黄嘌呤脱氢酶、组氨酸酶，天冬酰胺酶、脯氨酸氧化酶和运输尿素及谷氨酸的渗透酶。氮分解代谢物的阻遏似乎与同化氨的酶有关。 氮分解代谢物的调节 许多催化分解含氮基质的酶的合成受NH3或可被菌株迅速利用的氨基酸的阻遏。 因此，许多芽孢杆菌在含有一些氨基酸的培养基中生成的蛋白酶很少，从培养基中除去这类化合物常可大大增加酶的产量。 生长在各种培养基上的