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基因诊断技术讲义 第一节 扩增片段长度多态性 在基因组DNA 序列中存在５到10万个短重复序列(short tendom repeats, STR)，重复单元的长度不等，大部分有很高的多态性，PCR扩增后通过电泳检测扩增片段长度多态性(amplified fragment length polymorphism, Amp-FLP)，因此STR 多态性成为第二代多态性标记，在基因连锁分析中的应用越来越广泛。重复单元较长的STR 的PCR 产物可通过琼脂糖凝胶电泳分析，短的重复单元则需用聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamine gel, PAG)电泳分离。大部分STR扩增片段可用银染法显示，崐只有扩增效率较低的位点需参入同位素，通过放射自显影检测。短重复单元（如双核苷酸）的STR扩增片段会因聚合酶滑动(slipage)或合成中止的链再延伸，一个等位片段会产生多种长度的扩增片段，彼此相差一个重复单元。为了便于结果判断，通常用变性PAGE（同序列分析的PAGE）。 第二节 单链DNA构象多态性 单链构像多态性(single strand conformation polymorphism, SSCP)是指单链DNA 在溶液中形成立体构象，等长的DNA 片段因其序列中核苷酸的组成和排列顺序不同，形成的构像不同，在非变性PAGE时表现为电泳速度的差别。单链DNA 的构像分析对DNA 序列的改变非常敏感，常常一个碱基的差别都能显示出来。据此Hayashi 等人发明了SSCP分析方法。 SSCP的结果判定是通过与正常样品对比，观察条带位置的改变。分析多个样品时可不设正常对照。正常样品除未变性彻底的双链外，一般出现两条带，为正链和负链，电泳条件不好时，正负链分不开。有时会出现３条链，机理不清。出现额外区带时即可判断有多态性，多态性带有时为２条有时只有１条。双链的位置随电泳条件不同改变很大，设置双链对照是为了判别额外的带是多态性还是双链。当变性不彻底时会出现双链带，有多态性的样品，带型更多，除同源双链外还有异源杂合双链的带。 SSCP的检测条件因DNA片段及核苷酸取代而有很大差别，没有统一的电泳条件，下面列出的几个参数供摸索时参考。加样不要过量，过量加样不仅条带扩展拖尾，使多态性带与正常带重叠不易判断，还往往会变性不彻底而出现双链特别是异源双链的干扰。 具体操作如下： ⒈常规PCR 产生DNA 片段（可加入1 uCi 32P dCTP）。 ⒉配制PAG（非变性） 5％或6％聚丙烯酰胺（丙烯酰胺∶甲叉丙烯酰胺一般为49:1） 甘油浓度有３种：0％、5％、10％。 胶长不小于20 cm，胶厚0.4 mm。最好用鲨鱼齿加样梳。 ⒊预电泳 电泳温度依分离的片段特征而选定，一般试三种温度：室温（20℃）15℃或４℃，一般通过恒温循环水浴控制。预电泳１小时使胶的温度平衡。 ⒋DNA 样品处理 取适量的PCR 扩增产物加3 ul序列胶加样液（90甲酰胺，含少量二甲苯蓝和溴酚蓝染料），95℃加热变性2 min，冰浴中骤冷。同位素掺入的取1ul稀释10倍，加样3 ul，银染的一般用5 ul。 ⒌电泳 用吸管将加样孔中游离的丙烯酰胺和甘油吹洗干净，将样品加入，在单独的样品孔中加未经变性处理的PCR 产物作为双链DNA 标志。 电泳时有恒温控制时电压可高些，一般电泳功率30瓦，无恒温装置时可用电扇降温，亦可用200V电泳过夜。 ⒍放射自显影或银染显示分析结果。放射自显影的凝胶转贴到普通滤纸上，包保鲜膜压片-80℃曝光。 第三节 聚丙烯酰胺凝胶银染色 PCR 产物电泳后，将粘附凝胶的玻板浸在10％乙醇0.5％乙酸固定液中使胶脱落，在摇床上固定凝胶15min，换0.2％ AgNO3染色10min左右，用去离子水短暂冲洗３次，1.5％NaOH 0.4％甲醛显色至适度，最后用固定液终止显色。将显色好的凝胶转贴到普通滤纸上，真空抽干，保存。亦可照相保存结果。抽干的胶照相时，可用二甲苯处理滤纸使之透明。 硝酸银溶液可回收反复使用，随着染液的老化（耗竭），染色时间要逐渐延长。显色液混入染色液中会使染液很快失效。染色以后的去离子水冲洗对减轻本底非常重要，一定注意不得用自来水冲洗，自来水中离子会使凝胶变黑。 第四节 性别鉴定